劉喜平 崔國寧 董俊剛 曾慶濤

摘要：目的 比較參苓白術(shù)散與痛瀉要方對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠內(nèi)源性間充質(zhì)干細胞（MSCs）動員作用的影響。方法 20只SD雄性大鼠隨機分為空白組、模型組、參苓白術(shù)散組和痛瀉要方組，TNBS/乙醇法建立潰瘍性結(jié)腸炎模型。各給藥組給予參苓白術(shù)散與痛瀉要方灌胃，空白組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。灌胃結(jié)束后，提取外周血與骨髓MSCs進行原代培養(yǎng)，流式細胞術(shù)檢測骨髓與外周血來源MSCs。結(jié)果 骨髓來源MSCs：與空白組比較，模型組陽性細胞百分數(shù)明顯下降（P<0.05）；與模型組比較，參苓白術(shù)散組、痛瀉要方組陽性細胞百分數(shù)明顯升高，參苓白術(shù)散組優(yōu)于痛瀉要方組（P<0.05）。外周血來源MSCs：與空白組比較，模型組陽性細胞百分數(shù)明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，參苓白術(shù)散組、痛瀉要方組陽性細胞百分數(shù)明顯下降，參苓白術(shù)散組優(yōu)于痛瀉要方組（P<0.05）。結(jié)論 參苓白術(shù)散和痛瀉要方均具有促進模型大鼠骨髓來源MSCs增多、外周血來源MSCs減少作用，且參苓白術(shù)散優(yōu)于痛瀉要方。

關(guān)鍵詞：潰瘍性結(jié)腸炎；間充質(zhì)干細胞；參苓白術(shù)散；痛瀉要方；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.11.010

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）11-0041-05

Abstract： Objective To compare mobilization effects of endogeneous MSCs in the treatment of ulcerative colitis rats by Shenling Baizhu Powder and Tongxie Yaofang Decoction. Methods Twenty SD male rats were randomly divided into blank group， model group， Shenling Baizhu Powder group and Tongxie Yaofang Decoction group. TNBS/ethanol method was used to build the ulcerative colitis model. Administration groups were given Shenling Baizhu Powder and Tongxie Yaofang Decoction for gavage and model group and blank group were given normal saline for gavage. After gavage， MSCs from peripheral blood and bone marrow were extracted for primary culture. MSCs of bone marrow and peripheral blood were detected by flow cytometry. Results MSCs from bone marrow showed： Compared with the blank group， the percentage of positive cells in the model group decreased （P<0.05）； Compared with the model group， the percentage of positive cells in Shenling Baizhu Powder group and Tongxie Yaofang Decoction group increased， and the expression of Shenling Baizhu Powder group was more obvious （P<0.05）. MSCs from peripheral blood showed： Compared with the blank group， the percentage of positive cells in the model group increased （P<0.05）； Compared with the model group， the percentage of positive cells in Shenling Baizhu Powder group and Tongxie Yaofang Decoction group decreased， and the expression of Shenling Baizhu Powder group was more obvious （P<0.05）. Conclusion Shenling Baizhu Powder and Tongxie Yaofang Decoction have the function of promoting the increase of bone marrow-derived MSCs and the reduction of peripheral blood source of MSCs in model rats， and Shenling Baizhu Powder is better than Tongxie Yaofang Decoction.

Keywords： ulcerative colitis； MSCs； Shenling Baizhu Powder； Tongxie Yaofang Decoction； rats

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種免疫性疾病，是由多種因素引起的腸道系統(tǒng)炎癥疾病。目前治療主要是抑制炎癥，包括藥物、生物抑制劑、手術(shù)切除炎癥性腸部等手段，但這些治療方法都具有復(fù)發(fā)的局限性，其病情易于反復(fù)，遷延難愈。有研究表明，結(jié)腸黏膜干細胞位于結(jié)腸隱窩內(nèi)，數(shù)量很少，其對損傷結(jié)腸黏膜具有修復(fù)與重建作用，UC過程中結(jié)腸黏膜彌漫性損害，數(shù)量很少的結(jié)腸黏膜干細胞進一步減少，而減少的結(jié)腸黏膜干細胞可能是其遷延難愈的病因[1]，補充足夠的結(jié)腸黏膜干細胞可能是治療UC的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）具有向受損結(jié)腸黏膜遷移、歸巢的特性，可分化為結(jié)腸黏膜干細胞，MSCs遷移到受損的結(jié)腸黏膜數(shù)量要高于正常結(jié)腸黏膜[2]。然而MSCs主要來源于骨髓，在UC過程中，內(nèi)源性MSCs是否動員進入外周血？治療UC的常用方劑參苓白術(shù)散與痛瀉要方對內(nèi)源性MSCs動員特性影響有何不同？本研究觀察參苓白術(shù)散與痛瀉要方對UC大鼠模型內(nèi)源性MSCs動員作用的影響，同時以“以方測證”探討TNBS/乙醇法建立UC大鼠模型中醫(yī)證候類型，為臨床中醫(yī)藥參與MSCs治療UC提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物

SD雄性大鼠20只，SPF級，體質(zhì)量180～220 g，重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號SCXK（軍）2012-0011。飼養(yǎng)于溫度23～25℃、相對濕度40%～60%、12 h/12 h晝夜交替環(huán)境，自由攝食飲水。

1.2 藥物及制備

參苓白術(shù)散（麩炒白術(shù)、山藥、茯苓、白參各15 g，白扁豆12 g，蓮子肉10 g，麩炒薏苡仁各10 g，砂仁、桔梗各6 g，炙甘草9 g）與痛瀉要方（麩炒白術(shù)、麩炒山藥各12 g，防風6 g，陳皮9 g），飲片購于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房。按原方比例將上述二方藥物飲片分別浸泡30 min，煎煮2次，第1次加8倍水，煎煮1 h，取煎液，第2次加6倍水，煎煮30 min，取煎液，2次煎液混合，濃縮，按大鼠與人體劑量換算，參苓白術(shù)散濃縮為含原藥材2.26 g/mL，痛瀉要方濃縮為含原藥材0.78 g/mL。

1.3 主要試劑與儀器

5%TNBS（美國Sigma，S9951），DMEM-F12培養(yǎng)基（美國Gibco，HLM150312），胎牛血清（美國Gibco，HLC0101），胰蛋白酶（中國Beyotime，ST505），青/鏈霉素溶液（100X，中國Beyotime，C0222），臺盼藍粉末（美國Sigma，HZB0368），淋巴細胞分離液（中國TBD，D-5879），Rat CD29-PE（美國eBioscience，12-0291-81），IgG-PE（美國eBioscience，12-4714-71），Rat CD45-PE-Cyanine5.5（美國eBioscience，35-0459-42），IgG1-PE-Cyanine5.5（美國，eBioscience，35-0567-41），一抗Anti CD29（兔來源，美國Abcam，AB6776）、Anti CD105（鼠來源，美國Abcam，AB21222），二抗Anti FITC（抗兔，美國Abcam，AB6743）、Anti Cy3（抗兔，美國Abcam，AB6939）。流式細胞檢測儀（美國BD，F(xiàn)ACSVantage SE），電子分析天平（Precisa12A，瑞士，XB220A），烤片機（德國Leica，HI1220），切片機（德國Leica，CM1520），展片機（德國Leica，VT1200S），電熱壓力蒸汽消毒器（XDD，浙江紹興醫(yī)療器械總廠，YXQ-LS-100A），電熱恒溫鼓風干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械廠，GZX-914MBE），高速臺式離心機（湘儀離心機儀器有限公司，TGL16-WS），CO2培養(yǎng)箱（日本三洋，MCO-15AC-SC），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS，ECLIPSE Ti-s），0.22 μm混合纖維素濾膜（美國MILLIPORE，GSWP04700），80/200目不銹鋼細胞篩（上海生工，F(xiàn)513440-0001），細胞培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板（美國Costar，3599、3099），純水儀（美國MILLIPORE，ELIX3）。

2 實驗方法

2.1 造模、分組及給藥

實驗大鼠常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機抽取6只作為空白組，余下全部造模。7%水合氯醛（200 g/mL）大鼠腹腔注射麻醉。石蠟油潤滑經(jīng)肛門緩插輸液管至距肛門8 cm處，每200 g大鼠予5%TNBS 0.4 mL，將100 mg/kg TNBS與等體積50%乙醇混合共0.8 mL，再注入0.5 mL空氣，將大鼠頭朝下傾斜45°放置1 min，平躺待自然醒，每周1次，連續(xù)5周。造模結(jié)束后，各組隨機抽取大鼠2只，迅速脫頸處死，剖腹，取全部結(jié)腸，平分2段，沿腸系膜緣剪開腸腔，PBS沖洗2遍，4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，切片（厚約4 μm），HE染色觀察大鼠結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)變化，并與空白組比較，評價造模成功與否[3]。將成模大鼠隨機分為模型組、參苓白術(shù)散組和痛瀉要方組，各給藥組分別予參苓白術(shù)散與痛瀉要方藥液灌胃，空白組和模型組予等量生理鹽水灌胃。給藥體積2 mL/200 g，每日1次，共28 d。

2.2 大鼠外周血來源間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)、鑒定

灌胃結(jié)束后，水合氯醛麻醉，無菌條件下切開腹腔并暴露腹主動脈，采血針內(nèi)加入1000 U肝素抗凝，腹主動脈采血5 mL，用等量無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋后，加到含5 mL Ficoll-Paque Plus液離心管，用密度梯度離心法分離單個核細胞，2000 r/min離心20 min，收集交界面單個核細胞，PBS沖洗，1000 r/min離心5 min，重復(fù)3次，用含體積分數(shù)為10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基按106/mL密度將單個核細胞重懸，將單個核細胞懸液按每瓶4 mL接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。將消毒蓋玻片置于6孔板中，加0.1 mg/mL多聚賴氨酸后放入37 ℃孵箱中孕育1 h，取出6孔板，回收多聚賴氨酸，PBS沖洗3遍，并用紫外燈照射過夜備用。胰蛋白酶消化后，完全培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞懸液平均轉(zhuǎn)移至鋪有蓋玻片6孔板中，每孔添加培養(yǎng)基至2 mL，待細胞長滿6孔板底90%后，免疫熒光檢測。實驗重復(fù)3次。

2.3 大鼠骨髓來源間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)、鑒定

常規(guī)手術(shù)消毒，無菌條件下解剖分離，摘除雙側(cè)股骨，剔除骨表面肌肉及組織，從一端剪開骨髓腔，用預(yù)先抽入無血清DEME培養(yǎng)基的注射器沖洗骨髓腔，70 mm網(wǎng)篩過濾，將沖洗液收集入無菌平皿中。將平皿中液體移入50 mL離心管中，1000 r/min離心5 min，棄上清液，用培養(yǎng)液5 mL重懸細胞，然后加到含5 mL Ficoll-Paque Plus液離心管內(nèi)，用密度梯度離心法分離單個核細胞，2000 r/min離心20 min，收集交界面中間細胞，PBS沖洗，1000 r/min離心5 min，重復(fù)3次，用含體積分數(shù)為10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基按106/mL密度將單個核細胞重懸，將單個核細胞懸液按每瓶4 mL接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，于37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。鑒定方法同“2.2”項。

2.4 流式細胞儀檢測骨髓及外周血來源間充質(zhì)干細胞

分別收集1×106分離大鼠骨髓與外周血來源的MSCs，加入1 mL預(yù)冷PBS重懸細胞，再離心沉淀細胞，棄去上清液，可殘留約50 μL PBS，輕輕彈擊離心管底部分散細胞，避免細胞成團。各組加入5 μL CD29/PE與CD45/PC5.5抗體，并輕輕混勻，同時設(shè)置同型對照與空白組管。4 ℃冰箱避光孵育20 min后加入200 μL Staining Buffer，4 ℃、1000 r/min離心5 min，棄去上清液，洗3次，100 μL重懸細胞后流式細胞儀檢測。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 病理變化

空白組大鼠結(jié)腸組織黏膜結(jié)構(gòu)清晰，黏膜完整而無缺損，黏膜上皮細胞排列整齊，無炎性細胞浸潤，固有層可見毛細血管與淋巴管細胞，杯狀細胞比較豐富，排列整齊，腸腺比較規(guī)則；模型組大鼠結(jié)腸組織杯狀細胞嚴重變形，結(jié)腸黏膜缺失明顯，固有層腺體多數(shù)表現(xiàn)為不完整，杯狀細胞減少，部分細胞出現(xiàn)壞死，結(jié)腸黏膜炎性損傷，并有大量炎性細胞浸潤，符合UC病理組織特征，表明TNBS/乙醇誘導(dǎo)UC大鼠模型成功建立；參苓白術(shù)散組和痛瀉要方組大鼠結(jié)腸組織黏膜上皮細胞排列比較整齊，炎性細胞浸潤明顯減少。結(jié)果見圖1、圖2。

4.2 外周血及骨髓間來源充質(zhì)干細胞形態(tài)變化

剛接種的細胞形態(tài)主要表現(xiàn)為橢圓形與圓形不等細胞，細胞密集地懸浮于培養(yǎng)液中，折光性比較強，培養(yǎng)3 d后，部分細胞呈現(xiàn)類圓形或紡錘形，培養(yǎng)液中仍有大量未貼壁細胞懸浮，第1代細胞表現(xiàn)為：細胞貼壁生長，細胞呈現(xiàn)紡錘形、不規(guī)則形、三角形或多邊形等多種形態(tài)，細胞融合范圍80%～90%，而懸浮于培養(yǎng)液中混雜細胞較少?？梢婄R下骨髓來源MSCs密集程度明顯多于外周血來源MSCs密集程度，提示骨髓來源MSCs數(shù)量多于外周血來源MSCs數(shù)量。結(jié)果見圖3、圖4。

4.3 間充質(zhì)干細胞免疫熒光鑒定結(jié)果

藍色為DAPI標記，紅色為CD105標記，綠色為CD29標記，CD105、CD29均為陽性表達，下圖為合成照片，可觀察到細胞整體形態(tài)，發(fā)現(xiàn)細胞活性較好，骨髓來源MSCs被標記數(shù)量明顯多于外周血來源MSCs數(shù)量。見圖5。

4.4 骨髓及外周血來源間充質(zhì)干細胞流式細胞儀檢測結(jié)果

骨髓來源MSCs：與空白組比較，模型組陽性細胞百分數(shù)明顯下降（P<0.05）；與模型組比較，參苓白術(shù)散組和痛瀉要方組陽性細胞百分數(shù)均明顯升高，參苓白術(shù)散組優(yōu)于痛瀉要方組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。外周血來源：與空白組比較，模型組陽性細胞百分數(shù)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，參苓白術(shù)散組、痛瀉要方組陽性細胞百分數(shù)下降，參苓白術(shù)散組優(yōu)于痛瀉要方組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見圖6、圖7和表1。

5 討論

在低氧誘導(dǎo)因子1α高表達對心肌梗死大鼠MSCs動員研究中，給予低氧誘導(dǎo)因子1α錯義寡核苷酸組外周血MSCs數(shù)量較給予低氧誘導(dǎo)因子1α反義寡核苷酸組高，提示低氧誘導(dǎo)因子1α高表達與骨髓來源MSCs動員、起到一系列心肌組織自我修復(fù)等過程有關(guān)[4]，說明在病理狀態(tài)下，骨髓來源MSCs可動員進入外周血，進行受損組織的修復(fù)，這與Koning J J等[5]研究骨髓來源MSCs炎癥條件下可動員到遠處受損組織發(fā)揮修復(fù)作用具有一致性。臨床研究表明，在腦梗死治療中增加活血化瘀藥物可提高療效[6]，三七總皂苷為三七提取物之一，有活血化瘀的功效。研究發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷可通過促進骨髓中干細胞因子表達，降低CD54、CD106表達，從而促進骨髓來源MSCs動員進入外周血，提高歸巢細胞數(shù)[7]。

UC屬中醫(yī)學(xué)“腹痛”“腸癖”“泄瀉”等范疇，病因主要與外感病邪、情志損傷、飲食不節(jié)等相關(guān)。濕熱蘊腸、氣機壅滯是基本病機?；顒悠谥饕詽駸崽N腸、邪實阻滯為主，緩解期以本虛標實為主，主要表現(xiàn)為脾虛濕盛、正虛邪戀、病情遷延。方證相關(guān)是經(jīng)方臨床長期治療過程中總結(jié)出來的治療理念，《傷寒論》主要以方證對應(yīng)來指導(dǎo)臨床辨治[8]。依據(jù)方證相關(guān)，參苓白術(shù)散與痛瀉要方是治療UC的基本方劑，且臨床療效得到了肯定[9-10]。我們研究發(fā)現(xiàn)，在UC過程中參苓白術(shù)散與痛瀉要方均有促進骨髓來源MSCs增多、外周血來源MSCs減少的作用，參苓白術(shù)散促進作用優(yōu)于痛瀉要方，表明本實驗所選模型可能為中醫(yī)脾虛濕盛證模型。在骨髓中，模型組MSCs較空白組減少，說明UC過程可促進骨髓來源MSCs動員進入外周血。在外周血中，與空白組比較，模型組MSCs增多，而給藥組MSCs數(shù)量少于模型組，我們推測在二方干預(yù)治療下，外周血MSCs減少，其可能已經(jīng)遷移并歸巢到結(jié)腸黏膜進行受損結(jié)腸黏膜的修復(fù)。中醫(yī)認為“脾胃為后天之本，氣血生化之源”，而精氣血津液又可互化，參苓白術(shù)散益氣健脾、滲濕止瀉，痛瀉要方補脾柔肝、祛濕止瀉，二方具有扶正祛邪之功。UC病機主要為濕邪偏盛，祛除濕邪符合UC的病證治療，同時二方補脾，脾胃為人體氣血生化之源，通過補脾可達到啟化源、滋營衛(wèi)、益氣血、補臟腑、祛病邪。人體精、氣血、津液可互化，腎主藏精，主骨生髓，而MSCs主要存在于骨髓中[10]，其在特定的條件下可向多個胚層細胞分化[11]。采用中醫(yī)藥對UC進行對證治療，可促進骨髓來源MSCs增多，外周血來源MSCs減少，這為內(nèi)源性MSCs動員機制研究提供參考依據(jù)。對于動員進入外周血中MSCs是如何遷移并定植分化為結(jié)腸黏膜干細胞從而發(fā)揮治療作用，外周血微環(huán)境對MSCs產(chǎn)生怎樣的影響，需進一步研究。

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