馬晶 李錦玉?

p66Shc在心力衰竭大鼠血清中的表達(dá)及與氧化應(yīng)激的關(guān)系

馬晶 李錦玉?

目的 檢測(cè)p66Shc在心力衰竭大鼠血清中的表達(dá)并探討其與氧化應(yīng)激的關(guān)系。方法 SD大鼠分為心力衰竭組（HF組）和正常對(duì)照組（對(duì)照組）。檢測(cè)心力衰竭大鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）的活力及丙二醛（MDA）的含量；超聲心動(dòng)圖檢測(cè)心室舒張末內(nèi)徑（LVEDD）、左心室收縮末內(nèi)徑（LVESD）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）；RT-PCR檢測(cè)血p66Shc mRNA的表達(dá)，并對(duì)p66Shc的表達(dá)與LVEDD、LVESD、LVEF、MDA、SOD進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果 心力衰竭組SOD、LVEF明顯下降，MDA、p66Shc明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；心力衰竭組p66Shc mRNA的表達(dá)量與LVEDD、LVESD、MDA呈正相關(guān)（r=0.636、0.620、0.645，P＜0.05），而與LVEF、SOD呈負(fù)相關(guān)（r=-0.860、-0.650，P＜0.05）。結(jié)論 p66Shc與心力衰竭氧化應(yīng)激密切相關(guān)，p66Shc可能參與心力衰竭氧化應(yīng)激的過(guò)程，可為心力衰竭新的治療途徑提供依據(jù)。

心力衰竭 氧化應(yīng)激 p66Shc 超氧化物歧化酶 丙二醛

Objective To investigate the expression of adaptor protein p66shc in rats with heart failure and its relationship with oxidative stress. Methods Rat heart failure model was established by partially banding abdominal aorta.The levels of serum superoxide dismutase（SOD）and malondialdehyde（MDA）activity were examined.The left ventricular end diastolic diameter（LVEDD），left ventricular end systolic diameter（LVESD），left ventricular ejection fraction（LVEF）were measured by routine cardiac ultrasonography.The expression of p66Shc was determined by quantitative real time PCR. Results The levels of SOD and LVEF were signif i cantly lower while the levels of MDA and p66Shc were signif i cantly higher in HF group than that in control group（P＜0.05）.Linear correlation analysis showed that the expression of gene p66Shc was positively related with the level of LVEDD，LVESD and MDA（P＜0.05），but negative related with the level of LVEF and SOD（P＜0.05）.Conclusion P66shc is associated with states of increased oxidative stress. P66shc mRNA levels are increased in HF，which may be involved in the pathogenesis of HF through oxidative stress.

Heart failure，congestive Oxidative stress P66Shc SOD MDA

心力衰竭是臨床常見(jiàn)的心血管病，是各種心臟病發(fā)展的終末階段［1］。細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生是心力衰竭心肌損傷發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。p66Shc是一種新型長(zhǎng)壽調(diào)節(jié)基因，在調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞生命周期凋亡中發(fā)揮及其重要的作用。本研究通過(guò)測(cè)定心力衰竭大鼠和健康大鼠p66Shc、脂類(lèi)氧化應(yīng)激標(biāo)記物丙二醛（MDA）、抗氧化酶類(lèi)超氧化物歧化酶（SOD）表達(dá)水平，評(píng)估左心室舒張末內(nèi)徑（LVEDD）、左心室收縮末內(nèi)徑（LVESD）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF），探討p66Shc與MDA、SOD的表達(dá)水平改變與心力衰竭的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年SD大鼠（Ⅱ級(jí)）40只，雌雄各半，由復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，8周齡，體重（200±20）g。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)于2016年4月至6月在本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心完成。

1.2 動(dòng)物分組及模型建立 SD大鼠40只隨機(jī)分為正常對(duì)照組（對(duì)照組）和心力衰竭組（HF組），每組各20只。以腹主動(dòng)脈縮窄法建立左室壓力負(fù)荷心力衰竭模型。以4%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，分離右腎動(dòng)脈起始部約1.0cm處，27號(hào)注射針頭平行放置于腹主動(dòng)脈上，4號(hào)絲線一并結(jié)扎，造成腹主動(dòng)脈狹窄，且腹主動(dòng)脈直徑縮窄為0.9mm，然后抽出針頭，關(guān)腹縫合。經(jīng)右側(cè)頸總動(dòng)脈插管至左心室，測(cè)量左室舒張末壓（LVEDP），LVEDP≥15mmHg為心力衰竭成模的標(biāo)準(zhǔn)。正常對(duì)照組鈍性分離后，縫合線僅繞于腹主動(dòng)脈上，不結(jié)扎。

1.3 超聲心動(dòng)圖檢測(cè) 8周后存活的大鼠行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)LVEDD、LVESD，求3個(gè)心動(dòng)周期的平均值，并按照Teichholtz公式計(jì)算LVEF。

1.4 血清MDA含量、SOD活力檢測(cè) 第8周大鼠麻醉后采血，置于離心機(jī)中以3500r/min離心20min。取上清液，采用TBA法檢測(cè)血清MDA含量，黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)血清中SOD活力。實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.5 血清p66Shc mRNA表達(dá)檢測(cè) 第8周采集晨時(shí)空腹靜脈血5ml，采用美國(guó)sigma公司1077淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，將稀釋的血液緩慢加入到15ml分離液的液面上以2000r/min梯度離心20min，收集并洗滌云霧狀單個(gè)核細(xì)胞層，加入磷酸緩沖溶液重懸，于-80℃冰箱保存。采用Trizol法提取單核細(xì)胞中總RNA。加入1ml Trizol充分溶解細(xì)胞，加入0.2ml氯仿，用手劇烈震蕩30s，靜置2min，4℃條件下14000r/min離心20min，取上清液，加入0.5ml異丙醇混勻，-20℃靜置10min，14000r/min 4℃離心20min，棄去上清液，沉淀加入1ml 100%乙醇洗滌1次，4℃，14000r/min離心5min，棄去上清液；沉淀在室溫中放置10min晾干，加入20μl無(wú)RNA酶的ddH2O溶解，取1μl用紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的RNA純度及濃度，A260/A280在1.8～2.0。使用AB公司7500熒光定量PCR儀，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行定量PCR檢測(cè)p66Shc mRNA表達(dá)水平，使用相對(duì)定量方法（2—ΔΔCt）計(jì)算p66Shc表達(dá)量。p66Shc上游引物為5'-GAAGAGCCACCTGACCATC-3'，下游引物為5'-AGGCACCCGAAGAGCATC-3'；β-actin上游引物為5'-CGTGAAAAGACCCAGATCA-3'，下游引物為5'-CACAGCCTGGATGGCTACGT-3'。反應(yīng)條件：95℃ 30s；95℃ 5s；60℃ 34s，40個(gè)循環(huán)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布計(jì)量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性采用線性相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠心臟超聲及血清各指標(biāo)比較 見(jiàn)表1。

表1 兩組心臟超聲、血清MDA含量等指標(biāo)比較（x±s）

2.2 HF組p66Shc mRNA與LVEDD、LVESD、LVEF、MDA、SOD的相關(guān)性分析 相關(guān)分析顯示，p66Shc mRNA與LVEDD、LVESD、MDA呈正相關(guān)（r=0.636、0.620、0.645，P＜0.05），而 與 LVEF、SOD 呈負(fù)相 關(guān)（r=-0.860、-0.650，P＜0.05）。

3 討論

心力衰竭是多種心血管疾病的共同結(jié)局，是心臟病患者死亡的主要原因。氧化應(yīng)激是指機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)氧自由基的消長(zhǎng)失衡，引起活性氧在體內(nèi)蓄積的一種狀態(tài)，且超出機(jī)體對(duì)于氧化物的清除能力，因而對(duì)機(jī)體的組織器官造成損失的過(guò)程［2］。氧化應(yīng)激是心血管疾病的重要特征之一。SOD和MDA顯示組織的脂質(zhì)過(guò)氧化程度。心力衰竭時(shí)，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的激活，增加內(nèi)皮細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生，減少抗氧化物質(zhì)的表達(dá)，激活氧化應(yīng)激系統(tǒng)，參與心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。本資料結(jié)果顯示，HF組SOD明顯下降，MDA明顯升高，提示氧化應(yīng)激參與心力衰竭的發(fā)生過(guò)程。

p66Shc是調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞生命周期凋亡的關(guān)鍵蛋白，是線粒體活性氧產(chǎn)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白。自1999年首次報(bào)道p66Shc基因敲除的小鼠壽命、細(xì)胞活性氧及其誘導(dǎo)的凋亡明顯下降后，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)p66Shc 功能進(jìn)行大量研究［3］。Kumar 等［4］研究顯示，p66Shc可調(diào)控糖尿病誘導(dǎo)的血管氧化應(yīng)激和內(nèi)皮功能障礙。p66Shc基因敲除的小鼠缺血預(yù)處理后無(wú)心肌梗死面積的減少。抑制p66Shc介導(dǎo)的線粒體凋亡可減少大鼠腸缺血再灌注損傷［5］。本資料中，HF組p66Shc明顯高于對(duì)照組，且p66Shc與LVEDD、LVESD呈正相關(guān)，而與LVEF呈負(fù)相關(guān)，提示p66Shc與心力衰竭的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

p66Shc由廣泛表達(dá)于多種組織細(xì)胞中的Shc A基因編碼，分為p46Shc、p52Shc和p66Shc3種亞型。而p66Shc與p46Shc、p52Shc區(qū)別在于其N(xiāo)末端具有獨(dú)特的CH2結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域Ser36位點(diǎn)經(jīng)PKC-β磷酸化激活后，再經(jīng)異構(gòu)化，去磷酸化過(guò)程，轉(zhuǎn)移至線粒體內(nèi)，發(fā)揮促進(jìn)活性氧產(chǎn)生的作用［6］。Derungs等［7］研究發(fā)現(xiàn)，p66Shc在阿爾茨海默病的線粒體功能障礙和體內(nèi)氧化損傷中發(fā)揮作用，p66Shc消融可能是針對(duì)阿爾茨海默病認(rèn)知障礙的新型治療方法。急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者血單個(gè)核細(xì)胞p66Shc水平比穩(wěn)定性冠心病和正常對(duì)照明顯升高，且氧化應(yīng)激也增強(qiáng)，提示p66Shc介導(dǎo)的活性氧可能與斑塊破裂相關(guān)。本資料HF組p66Shc的表達(dá)量與MDA水平呈正相關(guān)，與SOD呈負(fù)相關(guān)，提示p66Shc的表達(dá)水平與心力衰竭氧化應(yīng)激密切相關(guān)，p66Shc可能參與心力衰竭氧化應(yīng)激的過(guò)程。

［1］ 張開(kāi)坤,吳世良.比索洛爾和美托洛爾治療慢性心力衰竭的療效觀察. 浙江臨床醫(yī)學(xué),2017,19(4)：680-682.

［2］ 馮學(xué)問(wèn),林海洋,仇晨峰.氧化應(yīng)激水平與2型糖尿病眼肌麻痹關(guān)系的初步研究. 浙江臨床醫(yī)學(xué),2015,17(2)：190-192.

［3］ 李聲娜,張新林,黃為. p66Shc與心血管疾病. 中華心血管病雜志,2014,42(11)：977-980.

［4］ Kumar S,Kim YR,Vikram A,et al. Sirtuin1-regulated lysine acetylation of p66Shc governs diabetes-induced vascular oxidative stress and endothelial dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2017, 114(7)：1714-1719.

［5］ Feng D,Yao J,Wang G,et al. Inhibition of p66Shc-mediated mitochondrial apoptosis via targeting prolyl-isomerase Pin1 attenuates intestinal ischemia/reperfusion injury in rats. Clinical Science, 2017,131(8)：759-773.

［6］ Edwards NA,Watson AJ,Betts DH,et al. P66Shc,a key regulator of metabolism and mitochondrial ROS production,is dysregulated by mouse embryo culture. Mol Hum Reprod,2016,22(9)：634-647.

［7］ Derungs R,Camici GG,Spescha RD,et al. Genetic ablation of the p66Shc adaptor protein reverses cognitive deficits and improves

上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生科技項(xiàng)目（PW2015B-17）

201399 上海市浦東醫(yī)院

*通信作者