張 群，周文化*，譚 歡，劉 偉

葡萄果肉組織的能量水平和細(xì)胞壁代謝對其自溶軟化的影響

張 群1,2，周文化1,*，譚 歡2，劉 偉2

為研究葡萄采后貯藏過程中自溶軟化與能量水平及細(xì)胞壁代謝的關(guān)系，比較貯藏初期和末期果皮超微結(jié)構(gòu)的變化。采后葡萄經(jīng)鈣聯(lián)合涂膜和熱處理后，低溫（（4.0±0.5） ℃）貯藏，定期測定果肉自溶指數(shù)、硬度、腐爛率、膜透性、能量物質(zhì)（三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、單磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP））含量及能荷（energy charge，EC）、細(xì)胞壁降解酶活力和細(xì)胞壁成分的變化，掃描電子顯微鏡觀察貯藏初期和末期不同處理果實內(nèi)果皮的超微結(jié)構(gòu)，以未處理組為對照。結(jié)果顯示：隨貯藏時間的延長，果實自溶指數(shù)、腐爛率和膜透性升高，硬度和能量物質(zhì)下降，多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、果膠甲酯酶（pectinesterase，PE）和纖維素酶（cellulase，Cx）活力上升，β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-Gal）活力在貯藏30 d內(nèi)下降，之后急劇升高。細(xì)胞壁組分原果膠、纖維素和半纖維素含量下降，水溶性果膠含量前期上升，后期下降；葡萄內(nèi)果皮的超微結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)了大的孔洞。葡萄果實自溶指數(shù)與能量水平、細(xì)胞壁降解酶活力和細(xì)胞壁組分緊密相關(guān)，果實自溶指數(shù)與ATP、ADP含量極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），和AMP顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與EC無明顯相關(guān)性（P＞0.05）；與PG、PE、Cx活力極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與β-Gal活力無明顯相關(guān)性（P＞0.05）；與原果膠、水溶性果膠、纖維素和半纖維素含量極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。鈣聯(lián)合涂膜和熱處理能夠維持組織的高能量狀態(tài)和致密的超微結(jié)構(gòu)，抑制PG、PE和Cx活力的升高，延緩細(xì)胞壁降解，延緩自溶軟化，其中涂膜顯著優(yōu)于熱處理（P＜0.05）。

葡萄；自溶軟化；能量水平；超微結(jié)構(gòu)；細(xì)胞壁代謝

葡萄（Vitis vinifera L.）屬漿果類落葉藤本植物，營養(yǎng)豐富。但葡萄果實皮薄、汁液多、抵抗力差，且葡萄果實成熟于高溫多雨夏季，采后在貯藏過程中易產(chǎn)生色澤、風(fēng)味、營養(yǎng)物質(zhì)等變化[1-3]，其中最顯著的特征變化是果肉質(zhì)地的軟化、流汁，這和龍眼采后“自溶”現(xiàn)象類似[4-5]，是限制葡萄貯藏的關(guān)鍵因素之一。目前普遍認(rèn)為，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)改變和組分發(fā)生降解是導(dǎo)致果實質(zhì)地軟化的主要原因[4-10]。與葡萄果肉軟化相關(guān)的細(xì)胞壁降解酶主要是多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、果膠甲酯酶（pectinesterase，PE）、纖維素酶（cellulase，Cx）和β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-Gal）等[6]。研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用鈣處理[11-16]和涂膜[2,7,15]措施能抑制細(xì)胞壁降解酶（PE、PG、Cx等）活力和減緩細(xì)胞壁物質(zhì)（原果膠、纖維素、半纖維素等）的降解，延緩果實的軟化[2,7,11-16]。葡萄自溶軟化過程中不僅外部形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，其內(nèi)部的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)也會發(fā)生變化，葡萄果肉組織超微結(jié)構(gòu)的變化可以直觀反映果肉品質(zhì)劣變的過程[17-18]。

果實采后仍是活的有機體，果實組織能量代謝活動繼續(xù)有序進行，細(xì)胞能量供應(yīng)不足，加速機體的衰老和死亡[19-27]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，園藝作物采后衰老與能量合成下降而造成的細(xì)胞能量虧缺有關(guān)[19-25]。張群等[28]研究發(fā)現(xiàn)貯藏中葡萄果肉組織會出現(xiàn)能量虧損而影響其生理品質(zhì)的劣變。Wu Ziming等[3]認(rèn)為熱處理能減緩葡萄軟化的部分原因可能是熱處理增加了碳水化合物代謝酶活性，提高了能量物質(zhì)的供應(yīng)，維持高的能量狀態(tài)。但具體的軟化與能量代謝的相關(guān)研究鮮見報道。

葡萄采后處理中常用的熱處理[2-3,6]和涂膜[2,14-15]可有效延緩果實衰老。鈣能維持和加強果實細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，調(diào)節(jié)果實的呼吸代謝和生理代謝，維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性和細(xì)胞膜系統(tǒng)的區(qū)室化，防止胞內(nèi)底物與酶的接觸而導(dǎo)致生理代謝上的紊亂[11-13,16]。葡萄采后采用鈣聯(lián)合短波紫外處理可延長保鮮期[13]，鈣聯(lián)合熱水處理可緩解梨的細(xì)胞壁代謝，延緩軟化[10]。研究發(fā)現(xiàn)對葡萄采后進行鈣聯(lián)合涂膜和熱水處理，可減少葡萄腐爛率[28]。但在葡萄采后處理方法中，采用鈣聯(lián)合涂膜和鈣聯(lián)合熱處理對紅提葡萄冷藏期間其果肉組織的能量水平和細(xì)胞壁代謝影響自溶軟化的研究鮮見報道。

本研究以‘紅地球’葡萄為研究對象，對其進行鈣聯(lián)合涂膜和熱處理并低溫貯藏，以未處理組為對照，探悉果肉自溶指數(shù)、硬度、腐爛率、膜透性、果肉組織的能量物質(zhì)、細(xì)胞壁降解相關(guān)酶（PG、PE、Cx和β-Gal）活力及細(xì)胞壁成分（原果膠、水溶性果膠、纖維素和半纖維素）在貯藏過程中的變化規(guī)律，并應(yīng)用掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）對不同處理葡萄在貯藏末期的果實內(nèi)果皮超微結(jié)構(gòu)進行觀察，旨在從能量水平和細(xì)胞壁代謝的角度探討葡萄果肉自溶軟化的機理，為延緩采后葡萄果實軟化衰老、延長果實保鮮期提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄（品種為歐亞種‘紅地球’葡萄），充分成熟，可溶性固形物含量14%以上，2015年8月20日采自湖南省澧縣張公廟鎮(zhèn)葡萄園，采前10 d停止施水，采收時間為7∶00～9∶00，采收無病害、無霉變、無機械損傷的果實，采收后裝入透氣的塑料筐內(nèi)，并于采收當(dāng)日運回中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院進行風(fēng)冷12 h，去除田間熱，于次日進行不同處理。

5’-磷酸腺苷鈉鹽（純度大于98.5%）、5’-二磷酸腺苷鈉鹽（純度大于95%）、5’-單磷酸腺苷鈉鹽（純度大于99.0%）、聚半乳糖醛酸、果膠、羧甲基纖維素鈉、p-硝基酚-β-D-吡喃半乳糖苷（純度大于99.0%） 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；乙腈（色譜純） 美國天地公司；氯化鈣、殼聚糖（均為食品級） 焦作冠通化工有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。實驗室用水（18 MΩ）由Milli-Q RG超純水系統(tǒng)制備。

1.2 儀器與設(shè)備

PDA 2010AT高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、UV7100紫外分光光度計日本Shimadzu公司；CT3質(zhì)構(gòu)分析（textural profile analysis，TPA）儀 美國Brookf i eld公司；Avanti J-26XP高效冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司；AL204電子天平、Delta 320 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Evols 10 SEM 德國卡爾蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 果實采后處理方法

對照組（CK組）：葡萄未進行處理，直接裝盤覆膜貯藏；鈣聯(lián)合涂膜處理組（CT組）：將葡萄在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%殼聚糖和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2% CaCl2溶液中浸泡8 min，果實全部浸沒，晾干備用[28]；鈣聯(lián)合熱處理（HT組）：葡萄在45 ℃的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2% CaCl2溶液中浸泡8 min，果實全部浸沒，晾干備用[28]。每個處理組3 個重復(fù)，每個重復(fù)3 個托盤，每個托盤裝果2.5 kg，表面覆上保鮮膜，于（4.0±0.5） ℃冷藏。處理結(jié)束時，取樣一次作為第0天的樣品，每隔10 d測定葡萄的自溶指數(shù)、硬度、腐爛率、膜透性、能量物質(zhì)、細(xì)胞壁成分和細(xì)胞壁降解相關(guān)酶活力，測定周期為40 d。

測定自溶指數(shù)和腐爛率時從每個重復(fù)中取1 個托盤，即每個處理組合計3 個托盤取果進行測定。能量物質(zhì)、細(xì)胞壁組分和降解酶活力測定從每個重復(fù)中取1 個托盤，即每個處理組合計3 個托盤，葡萄果粒全部液氮粉碎后放于-70 ℃冰箱內(nèi)保存，取樣進行測定。硬度和膜透性是從每個重復(fù)中取1 個托盤，合計3 個托盤進行測定，其中內(nèi)果皮組織SEM掃描在貯藏初期和貯藏末期進行。

1.3.2 果肉自溶評價

參照趙云峰[4]、林河通[5]等的方法。每次隨機取50 個果實，按照果肉自溶面積大小把果肉自溶程度分為5 級。0 級：果肉有彈性、果肉無自溶；1 級：果肉變軟、果肉自溶面積＜1/4；2 級：果肉變軟、流汁，1/4≤果肉自溶面積＜1/2；3 級：果肉變軟、流汁，1/2≤果肉自溶面積＜3/4；4 級：果肉糜爛，果肉自溶面積≥3/4。按照公式（1）計算果肉自溶指數(shù)。

1.3.3 內(nèi)果皮組織SEM掃描

參照劉峰娟等[17]的方法，略有改進。用雙刃刀片將‘紅地球’葡萄果皮切成1 mm×1 mm×2 mm，環(huán)氧樹脂包埋，用超薄切片機切片，厚度為60 nm。加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛（0.1 mol/L，pH 6.8磷酸鹽緩沖液配制）溶液中，在4 ℃冰箱內(nèi)固定24 h。經(jīng)相應(yīng)的磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.8）漂洗后，用體積分?jǐn)?shù)50%、70%、80%、90%、100%丙酮溶液梯度脫水，各級30 min。再用體積分?jǐn)?shù)為100%的叔丁醇浸沒10 min后，放入真空干燥器中干燥40～60 min。干燥后用電導(dǎo)膠分別把樣品黏貼在樣品臺上，黏貼時樣品觀察面朝上，用鍍膜儀鍍金膜，于l5 kV加速電壓下觀察掃描結(jié)果。

1.3.4 腐爛率的測定

每10 d對貯藏葡萄進行質(zhì)量測定，分別測定腐爛果的質(zhì)量，并按式（2）計算腐爛率。

1.3.5 硬度測定

將保留果梗的葡萄橫放于TPA夾具正下方，進行硬度測試，選用的夾具直徑為50.8 mm，長20 mm的圓柱形探頭TA 25/1000。經(jīng)預(yù)實驗選取合適的測試參數(shù)：目標(biāo)類型為TPA實驗，距離4 mm，觸發(fā)點負(fù)載50 N，測試速率0.5 mm/s，循環(huán)2 次。由質(zhì)地特征曲線得到表征果實質(zhì)地狀況的力學(xué)參數(shù)，其中硬度以雙峰曲線中第1個峰的最大值表示，單位為N。每次取20 粒果實，分別在果實的對角線取2 個點，進行測定，取平均值。測試溫度：室溫（18～20 ℃）。

1.3.6 細(xì)胞膜透性的測定

用電導(dǎo)儀測定葡萄果肉圓片浸提液的電導(dǎo)值，煮沸后再測定浸提液的電導(dǎo)值，以前后2 次電導(dǎo)值之比所得的相對電導(dǎo)率變化來表示細(xì)胞膜透性的大小。

1.3.7 能量物質(zhì)含量測定

參照Liu Hai等[21]的方法，略作調(diào)整。取葡萄果肉組織2 g（-70 ℃冰箱內(nèi)液氮粉碎的樣品），加入10 mL 0.6 mol/L高氯酸，冰浴研磨提取1 min，于4 ℃、16 000×g離心15 min。取5 mL上清液迅速用1.0 mol/L KOH中和至pH 6.5～6.8，冰浴中穩(wěn)定30 min使高氯酸沉淀，之后經(jīng)4℃、8 000×g離心5 min，取上清液定容至5 mL，并過0.45 μm微孔濾膜過濾。用HPLC法測定三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、單磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）的含量。色譜條件為C18反相柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；檢測波長254 nm；流動相：pH 7.0的20 mmol/L磷酸氫二鉀緩沖溶液（A相），體積分?jǐn)?shù)60%乙腈（B相），A相與B相為4∶6（V/V），柱溫30 ℃，流速0.8 mL/min；進樣體積20 μL。定量方法采用外標(biāo)法，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品保留時間和峰面積進行定性定量[21]。按照公式（3）計算能荷（energy charge，EC）。

式中：ATP、ADP、AMP分別為果肉組織中的3 種能量物質(zhì)的含量/（μg/g）。

1.3.8 葡萄果實果肉中細(xì)胞壁降解酶的提取和活力的測定

參照趙云峰[4]、王玲利[10]等的方法提取細(xì)胞壁降解酶。PE活力以每小時消耗1 μmol NaOH的酶用量為1 個酶活力單位，結(jié)果以U/g表示；PG活力以每小時生成1 μmol半乳糖醛酸的酶用量為1 個酶活力單位，結(jié)果以U/g表示；Cx活力以每小時生成1 μmol葡萄糖的酶用量為1 個酶活力單位，結(jié)果以U/g表示。β-Gal活力以每小時每毫克果肉產(chǎn)生1 μmol硝基酚為一個酶活力單位，結(jié)果以U/mg表示。以上各指標(biāo)均重復(fù)測定3 次。

1.3.9 葡萄果實果肉中細(xì)胞壁成分的測定

參照趙云峰[4]、王玲利[10]等的方法測定果肉原果膠、水溶性果膠、纖維素、半纖維素等細(xì)胞壁組分含量，單位mg/g。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2010和Origin 8.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用Tukey方法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 果肉自溶指數(shù)、果實硬度、腐爛率、膜透性和內(nèi)果皮超微結(jié)構(gòu)的變化

圖1 葡萄果實貯藏期間果肉自溶指數(shù)（a）、果實硬度（b）、腐爛率（c）和細(xì)胞膜透性（d）的變化Fig. 1 Changes in aril breakdown index (a), hardness (b), decay percentage (c) and cell membrane permeability (d) in grape fruits at different storage times

葡萄采后極易出現(xiàn)果肉自溶軟化。圖1a表明葡萄果肉自溶指數(shù)隨貯藏時間的延長呈幅度不同的線性增加趨勢。3組葡萄果肉自溶指數(shù)在0～10 d內(nèi)無顯著差異（P＞0.05）；貯藏到40 d時，CK組的大部分果肉發(fā)生自溶軟化和腐爛，CT組葡萄的自溶指數(shù)顯著比CK組和HT組低（P＜0.05），表明鈣聯(lián)合熱處理和鈣聯(lián)合涂膜處理均能延緩葡萄果實自溶軟化，與熱水處理龍眼[4]、熱水處理葡萄[14-15]及涂膜處理葡萄的研究結(jié)果一致。Wu Ziming[3]、Yuan Xiaozhuan[29]等研究認(rèn)為熱處理減緩軟化的部分，原因可能是熱處理增加了碳水化合物代謝酶活性，提高了能量物質(zhì)的供應(yīng)，維持了高的能量狀態(tài)，但軟化與能量代謝的具體相關(guān)性還待進一步的研究。鈣聯(lián)合涂膜延緩自溶軟化效果優(yōu)于鈣聯(lián)合熱處理，可能是殼聚糖涂膜處理在葡萄果粒的表面形成一層保護膜，在某種程度上減弱果實的呼吸作用，減少營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，降低蒸騰作用[7,14]。

硬度是果實軟化的直觀表現(xiàn)。圖1b表明，葡萄果實硬度隨貯藏時間的延長逐漸下降，與張昆明等[30]對不同保鮮膜包裝的葡萄的研究結(jié)果一致。圖1b顯示葡萄果實經(jīng)不同處理后硬度有所改變，CK組的初始硬度值為（12.57±1.13） N，CT組和HT組的硬度值分別為（14.62±1.41）、（10.17±0.92） N，可見熱處理降低了葡萄的初始硬度，這與Wu Ziming[3]、李珍[2]等的研究結(jié)果相同。鈣聯(lián)合涂膜處理則增大硬度，可能鈣與果膠形成果膠酸鈣，涂膜形成保護膜，兩者共同作用增大了果實的硬度。在貯藏初期（貯至10 d），CK組、CT組和HT組硬度分別下降了32%、26%和21%，CK組下降最明顯。貯藏至40 d，CK組大多數(shù)葡萄已經(jīng)腐爛，不能進行下一步實驗。在整個貯藏期間，CT組葡萄果實硬度高于HT組和CK組，這說明鈣聯(lián)合涂膜能夠延緩葡萄果實的軟化，因為涂膜形成了保護膜，降低營養(yǎng)物質(zhì)的損耗[2,7,14-15]，鈣延緩細(xì)胞壁物質(zhì)的降解，從而延緩葡萄果實的軟化[11-13,16]。

腐爛率是葡萄感官品質(zhì)變異程度的一個重要指標(biāo)，由圖1c可看出，隨貯藏時間的延長，葡萄腐爛率呈上升趨勢。CT組和HT組葡萄貯藏至20 d前未發(fā)現(xiàn)腐爛，但CK組則出現(xiàn)了（11.64±1.08）%的腐爛率，這可能是涂膜和熱處理增加了果皮和果肉中抗真菌基因的表達誘導(dǎo)并激活耐腐機制，抑制葡萄果實表面微生物的生長繁殖[3,11,14-15]。但貯藏至30 d時，CT組和HT組腐爛率分別為（9.86±0.84）%和（15.84±1.48）%，而CK組為（30.26±2.84）%，是處理組的2 倍多，不同組間腐爛率差異顯著（P＜0.05）。貯藏至40 d時，各組的腐爛率均快速上升，CK組達（69.72±6.42）%，大多數(shù)葡萄已不能食用，CT組為（38.82±3.62）%，HT組為（48.82±4.56）%，處理組間差異顯著（P＜0.05），HT組比CT組高約10%，可能熱處理后葡萄果實的起始硬度下降，紅提汁多，水分高，加速果實的軟化和腐爛[2-3]。

果實相對電導(dǎo)率大小可表示細(xì)胞膜透性的大小[20-27]。由圖1d可知，‘紅地球’葡萄果實細(xì)胞膜的相對電導(dǎo)率隨貯藏時間的延長而增加。在同一貯藏時間，3 組的相對電導(dǎo)率從大到小是CK組＞HT組＞CT組，三者差異顯著（P＜0.05）。可見CT組和HT組顯著抑制了膜滲透性的上升（P＜0.05），保持了細(xì)胞膜良好的完整性，延緩果實衰老軟化，在減輕葡萄果實自溶軟化方面起到了有效的作用[3,11,14-15]，且鈣聯(lián)合涂膜效果要優(yōu)于鈣聯(lián)合熱處理。

統(tǒng)計分析表明，葡萄自溶指數(shù)與組織細(xì)胞膜透性呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），可能因為細(xì)胞膜透性增加，細(xì)胞壁組分與降解酶的區(qū)室化分布破壞，大分子可以進入，促進了相關(guān)酶如果膠酶等與底物接觸而加速軟化[4-5,7]。

葡萄自溶軟化是一種品質(zhì)劣變的過程，在這個過程中葡萄組織內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。果實細(xì)胞胞間層結(jié)構(gòu)改變，細(xì)胞壁總體結(jié)構(gòu)破壞以及胞壁物質(zhì)降解，宏觀上果實變軟，微觀上表現(xiàn)為細(xì)胞壁微絲排列由緊密有序變得松散無序，并部分分解，中膠層電子密度由致密變稀松，細(xì)胞壁不均勻，出現(xiàn)許多波形皺褶[4]。

圖2為貯藏初期和貯藏末期3 組葡萄內(nèi)果皮超微SEM掃描結(jié)果。貯藏初期（圖2d），葡萄內(nèi)果皮組織結(jié)構(gòu)整齊致密、分布均勻，有清晰的明暗結(jié)構(gòu)，沒有孔洞和溝壑，與劉峰娟等[17]對新鮮葡萄SEM結(jié)果一致。但在貯藏40 d后，不同處理的葡萄內(nèi)果皮組織有差別（圖2a～c）。CK組葡萄品質(zhì)嚴(yán)重下降，葡萄果肉組織稀松，有很多較深較大孔洞，已失去食用價值，與趙云峰等[4]對龍眼果實貯藏期間果肉自溶時細(xì)胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化的結(jié)果一致；CT組果肉組織較平滑、結(jié)構(gòu)較緊密；HT組的果肉組織疊層較CT組多，且更稀疏，因為鈣聯(lián)合涂膜可在葡萄表面形成一層膜，使果蔬內(nèi)部形成一個低O2、高CO2的微環(huán)境，可以起到更好的保護作用，從而更好地延緩軟化；但兩個處理組內(nèi)果皮組織超微結(jié)構(gòu)顯示中均沒有出現(xiàn)較深孔洞，可能是由于兩種處理能降低葡萄果肉細(xì)胞壁降解酶活力，從而減緩細(xì)胞壁組分的降解，延緩果肉自溶發(fā)生。

圖2 不同處理的葡萄內(nèi)果皮組織的超微結(jié)構(gòu)（×200）Fig. 2 Ultrastructure of inner pericarp in grape fruits with different treatments before and after 40 days of storage (×200)

2.2 葡萄果肉組織的ATP、ADP、AMP含量及EC與自溶軟化的關(guān)系

圖3 不同貯藏時間葡萄果實中ATP（a）、ADP（b）、AMP（c）含量和EC（d）的變化Fig. 3 Changes in ATP (a), ADP (b) and AMP (c) contents, and EC (d)of grape fruits at different storage times

采收時葡萄果肉組織有高水平的ATP、ADP含量和EC值（圖3a、b、d），相對低水平的AMP含量（圖3c），這與桃、荔枝、芒果、油木奈、梨貯藏初期能量物質(zhì)結(jié)果一致[20-27,31]。因為ATP、ADP和EC在合成細(xì)胞膜脂肪酸中發(fā)揮主要作用，細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的變化可導(dǎo)致細(xì)胞膜性質(zhì)發(fā)生變化，如膜透性增加、細(xì)胞衰老[32]。

在整個貯藏期間，ATP含量隨貯藏時間的延長不斷下降。CK組與處理組間葡萄組織中ATP含量差異顯著（P＜0.05），CT組ATP含量在貯藏后期（20～40 d）顯著高于HT組（P＜0.05）。處理組ADP含量的變化與ATP含量變化類似。由圖3b可以看出，在整個貯藏期間，除40 d外，處理組間ADP含量無顯著性差異（P＞0.05），但均比CK組高，可能因為適當(dāng)?shù)靥幚碓谀撤N程度上可減弱果實的呼吸作用，保持低的呼吸水平[3,14,31]。葡萄果肉組織中AMP含量在10 d內(nèi)增加，然后下降。貯藏至20～30 d時，AMP含量下降，3 組間差異顯著（P＜0.05）。在貯藏中后期（10～40 d），處理組的葡萄組織中AMP含量要高于CK組，其中CT組AMP含量顯著高于HT組（P＜0.05），但CK組與HT組間無顯著差異（P＞0.05）。

綜上所述，鈣聯(lián)合涂膜比鈣聯(lián)合熱處理能更好地延緩ATP、ADP、AMP含量下降，果肉組織處于高能量狀態(tài)，且自溶指數(shù)和腐爛率低（2.1節(jié)），部分原因可能是由于經(jīng)過鈣聯(lián)合涂膜處理后葡萄果實中碳水化合物代謝的酶活力增加，加強了能量物質(zhì)的供應(yīng)[14-15]。不同處理如何維持高水平的能量及保持葡萄硬度的機理待進一步研究。

EC大小反映細(xì)胞中腺苷酸系統(tǒng)的能量狀態(tài)，是細(xì)胞內(nèi)最重要的能量轉(zhuǎn)換與調(diào)節(jié)系統(tǒng)[20-27,31]。由圖3d可知，3 組葡萄的EC變化幅度為0.51～0.65，總體呈下降趨勢。貯藏10～30 d，EC有小幅的上升，因在此期間，AMP含量下降幅度大于ATP和ADP含量。在貯藏末期，EC值緩慢下降，HT組EC最高，CT組與CK組無顯著性差異（P＞0.05）。

葡萄采后果肉軟化與能量水平的關(guān)系鮮見報道，但果蔬的衰老劣變與能量代謝有密切關(guān)系[19-28,31]。統(tǒng)計分析表明，果肉自溶指數(shù)與ATP、ADP含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與AMP含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。葡萄硬度與ATP含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與ADP、AMP含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與EC無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。所以，葡萄果實自溶軟化及硬度的下降與能量水平密切相關(guān)，ATP、ADP、AMP水平降低，果實自溶軟化不斷加劇，其機理可能是在果實衰老軟化中，細(xì)胞膜透性增加，膜完整性受損，膜上的能量代謝酶的功能喪失，影響了能量的供應(yīng)[19-28,31]。

2.3 果肉細(xì)胞壁降解酶活力的變化與自溶軟化的關(guān)系

圖4 葡萄果實貯藏期間果肉組織中PG（a）、PE（b）、Cx（c）和β-Gal（d）活力的變化Fig. 4 Changes in PG (a), PE (b), Cx (c) and β-Gal (d) activities in grape fruits at different storage times

PG的主要功能是水解果實細(xì)胞壁中果膠酸的1,4-2-D-半乳糖苷酶，生成低聚半乳糖醛酸，導(dǎo)致細(xì)胞壁解體，最終使果實軟化[4-10,16]。葡萄果肉組織的PG活力在貯藏過程中逐漸上升（圖4a）。采后貯藏至10 d內(nèi)，3 組間PG活力無顯著差異（P＞0.05）；貯藏10～30 d時，CT組PG活力顯著低于CK、HT組（P＜0.05），CK和HT組間差異不顯著（P＞0.05）；貯藏至40 d時，葡萄果肉組織的PG活力大小依次為CK組＞HT組＞CT組，3 組差異顯著（P＜0.05）。可見，在貯藏中后期鈣聯(lián)合涂膜和鈣聯(lián)合熱處理均可抑制PG活力上升。Ca2+能維持細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)的區(qū)域化，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上細(xì)胞裂解酶到達作用位點，延緩細(xì)胞壁物質(zhì)降解[10,12]，從而延緩果肉自溶軟化和腐爛。適宜強度的熱處理可使PG活力降低，抑制果實水溶性果膠含量的上升和非水溶性果膠含量的下降，從而達到延緩果實軟化的目的[3-4,6,10]。涂膜處理有效抑制PG活力，延緩原果膠向可溶性果膠轉(zhuǎn)變[3-4,6,10,15]。但葡萄果實經(jīng)熱處理后，外果皮受熱收縮，氣孔關(guān)閉，合成的熱激蛋白形成了一層保護膜[4,10]，Ca2+進入果肉組織受阻，因此，熱處理抑制PG活力的能力不如涂膜組（P＜0.05）。

PE對果膠物質(zhì)的降解和果肉自溶起輔助作用，其生理意義在于為PG準(zhǔn)備作用底物，果膠的降解是在PG和PE的協(xié)同作用下[4-8,10,12]。采后葡萄果肉組織PE活力總體上升（圖4b）。貯藏初期PE活力為（87.14±7.72） U/g；貯藏至10 d時，CK組、HT組、CT組果肉組織的PE活力增幅分別為189.99%、159.95%和127.55%，且差異顯著（P＜0.05），貯藏至40 d時，3 組葡萄果肉組織的PE活力無顯著性差異（P＞0.05）。在整個貯藏期間，CK組果肉的PE活力均大于處理組，合適的處理可抑制PE活力上升，鈣聯(lián)合涂膜抑制效果優(yōu)于鈣聯(lián)合熱處理。

Cx與細(xì)胞壁降解和質(zhì)地軟化啟動的關(guān)系密切，Cx引起纖維素以及難溶性的半纖維素向易溶的半纖維素轉(zhuǎn)化，直接導(dǎo)致細(xì)胞壁中P—C—H“經(jīng)緯結(jié)構(gòu)松散”，導(dǎo)致果肉出現(xiàn)軟化[4-10]。葡萄果肉中Cx活力呈線性升高（圖4c），造成纖維素降解、細(xì)胞壁解體和果實軟化。貯藏初期葡萄果實Cx活力僅為（49.02±3.64） U/g；在貯藏中期，其活力為CT組＜HT組＜CK組，表明合適的處理在一定程度上抑制了貯藏中期Cx活力的上升，抑制細(xì)胞壁的降解，降低了果實軟化的速率，與趙云峰等[4]對龍眼的熱處理和羅自生等[7]對梨果實涂膜處理結(jié)果一致，但鈣聯(lián)合涂膜抑制效果優(yōu)于鈣聯(lián)合熱處理。貯藏結(jié)束時，葡萄果實Cx活力分別為CK組（75.28±4.18） U/g、CT組（76.86±7.70） U/g、HT組（75.84±5.84 ）U/g，三者無顯著差異（P＞0.05）。

β-Gal通過降解果膠多聚醛酸側(cè)鏈的半乳糖殘基，降解果膠聚合體，破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，從而使果實軟化[4-5]。從圖4d中可知，采后葡萄果肉β-Gal活力在貯藏0～30 d內(nèi)呈下降趨勢，后30～40 d持續(xù)升高，且CT組＞HT組＞CK組，與趙云峰等[4]對龍眼果實的研究結(jié)果一致。但葡萄果肉組織的β-Gal活力與自溶指數(shù)無明顯相關(guān)性（P＞0.05），這與薛炳燁等[33]對草莓的研究結(jié)果類似，說明β-Gal不是引起葡萄果肉自溶軟化的主要降解酶，與β-Gal在龍眼自溶軟化后期起重要作用結(jié)果不一致[4-5]，具體原因還待進一步的研究分析。

本研究中葡萄果肉自溶指數(shù)與PG、PE、Cx活力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），所以相關(guān)細(xì)胞壁降解酶（PE、PG和Cx）影響采后葡萄果肉自溶軟化，與龍眼、葡萄、楊桃和草莓軟化的關(guān)鍵因子結(jié)果一致[4-6,8,33]。而且鈣聯(lián)合涂膜和熱處理可抑制降解酶活力的上升，延緩果實自溶軟化，鈣聯(lián)合涂膜處理的抑制效果優(yōu)于鈣聯(lián)合熱處理。

2.4 果肉細(xì)胞壁組分變化與自溶軟化的關(guān)系

圖5 葡萄果實貯藏期間果肉原果膠（a）、水溶性果膠（b）、纖維素（c）和半纖維素（d）含量的變化Fig. 5 Changes in protopectin (a), water soluble pectin (b), cellulose (c)and semi-cellulose (d) contents in grape fruits during storage

果肉組織胞間層結(jié)構(gòu)改變造成細(xì)胞分離和胞壁物質(zhì)降解，細(xì)胞間黏合力下降，從而引起果實軟化[4-10,12]。如圖5a所示，隨貯藏時間延長，原果膠含量降低，CK、CT和HT組果肉中原果膠含量由貯藏前（1.88±0.12）mg/g分別降至（0.45±0.046）、（0.86±0.082）、（0.68±0.06） mg/g?？梢姡m當(dāng)?shù)靥幚砜裳泳徳z下降，自溶指數(shù)與原果膠含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與龍眼自溶結(jié)果一致[4-5]。PG和PE協(xié)同作用促進原果膠降解，原果膠下降與PG、PE活力升高呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。如圖5b所示，水溶性果膠含量先上升，在第20天時達高峰，之后逐漸下降，高峰時CK組、HT組和CT組水溶性果膠含量分別為采收時的1.31、1.19、1.10 倍；40 d時CK組中水溶性果膠含量為（0.34±0.02） mg/g、CT組為（1.38±0.14） mg/g、HT組為（0.90±0.08） mg/g，三者差異顯著（P＜0.05）。統(tǒng)計分析表明，葡萄果肉自溶指數(shù)與水溶性果膠含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。

果肉自溶軟化不僅與果膠降解有關(guān)，而且與纖維素的結(jié)構(gòu)變化有關(guān)[4-10,12]。在整個貯藏期間，果肉纖維素和半纖維素含量快速下降（圖5c、d），纖維素和半纖維素的分解為果膠質(zhì)的降解提供重要的條件，與龍眼自溶結(jié)果一致[4-5]。貯藏至40 d時，CK組、CT組和HT組的葡萄果肉組織中纖維素含量由貯前的（2.84±0.22） mg/g分別下降到（0.04±0.00）、（0.57±0.07）、（0.45±0.04） mg/g，下降幅度達99%、80%和84%，采后處理可緩解纖維素含量下降，但CT組纖維素含量高于HT組和CK組。貯藏初期半纖維素含量為（1.24±0.23） mg/g；貯藏至30 d，三者半纖維素含量差異顯著（P＜0.05），葡萄果肉組織中半纖維素含量大小依次是CT組＞HT組＞CK組；貯藏至40 d時，CK組、CT組和HT組的葡萄果肉組織中半纖維素含量分別下降到（0.00±0.00）、（0.24±0.16） mg/g和（0.01±0.01） mg/g，下降幅度達100%、64%和99%，CT組與CK、HT組間差異顯著（P＜0.05），但CK組和HT組間差異不顯著（P＞0.05）。統(tǒng)計分析表明，葡萄果肉自溶指數(shù)與纖維素、半纖維素含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），這與龍眼自溶結(jié)果一致[4-5]。適當(dāng)?shù)牟珊筇幚砜墒估w維素酶活力降低，果膠質(zhì)與纖維素不易分離，果膠質(zhì)不能順利分解，纖維素含量高，自溶指數(shù)低，這與龍眼自溶結(jié)果一致[4-5]。

3 結(jié) 論

本研究比較了鈣聯(lián)合涂膜處理、鈣聯(lián)合熱處理和未處理3 組葡萄果實低溫貯藏下果肉自溶軟化與果肉組織能量水平和細(xì)胞壁代謝的變化及相互關(guān)系，且進行了貯藏初期和末期果實內(nèi)果皮組織的超微結(jié)構(gòu)SEM觀察。研究認(rèn)為隨貯藏時間的延長，葡萄果肉出現(xiàn)自溶軟化、硬度下降、腐爛率升高、能量水平下降、細(xì)胞膜透性增大、細(xì)胞膜完整性被破壞、內(nèi)果皮組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)大的空洞、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)被破壞、細(xì)胞壁降解酶與底物的區(qū)室化作用被破壞，引起果肉分解軟化。自溶指數(shù)與ATP、ADP呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與AMP呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與EC水平無明顯相關(guān)性（P＞0.05），與細(xì)胞壁降解酶（PG、PE和Cx）活力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與β-Gal活力無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。自溶指數(shù)與細(xì)胞壁組分（原果膠、水溶性果膠、纖維素和半纖維素）含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。表明葡萄果肉衰老中的自溶軟化與果肉組織結(jié)構(gòu)、能量水平和細(xì)胞壁代謝特性有密切關(guān)系。

鈣聯(lián)合涂膜和鈣聯(lián)合熱處理可減輕葡萄內(nèi)果皮超微結(jié)構(gòu)的損傷，較好地保持細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的完整性。鈣聯(lián)合涂膜和鈣聯(lián)合熱處理緩解膜透性增加，維持葡萄組織高能量水平，抑制細(xì)胞壁降解酶降解細(xì)胞壁組分，延緩葡萄果肉組織的自溶軟化；但鈣聯(lián)合涂膜處理在延緩果肉自溶軟化和維持高的能量水平和低的細(xì)胞壁代謝能力方面要顯著優(yōu)于鈣聯(lián)合熱處理（P＜0.05）。

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Effects of Energy Level and Cell Wall Metabolism on Aril Breakdown in Grape Fruits

ZHANG Qun1,2, ZHOU Wenhua1,*, TAN Huan2, LIU Wei2
(1. College of Food Science and Engineering, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China;2. Hunan Agricultural Product Processing Institute, Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410125, China)

In order to understand the relationship of aril breakdown with energy levels and cell wall metabolism in harvested grapes, the ultrastructural changes in the inner pericarp were examined during the early and late stages of storage.‘Red globe’ grapes were subjected to CaCl2immersion combined with chitosan coating or heat treatment and then stored at (4.0 ± 0.5) ℃, and the untreated samples were used as a control. Changes in aril breakdown index, hardness, decay percentage, cell membrane permeability, energy contents (adenosine triphosphate (ATP), adenosine diphosphate (ADP) and adenosine monophosphate (AMP)), energy charge (EC), cell wall-degrading enzyme activities and cell wall components were monitored at regular intervals during storage. The results indicated that aril breakdown index, decay incidence and cell membrane permeability increased, hardness and energy contents declined, and the activities of the cell walldegrading enzymes polygalacturonase (PG), pectinesterase (PE) and cellulase (Cx) ascended with storage time; however,β-galactosidase (β-Gal) activity dropped during the fi rst 30 days, followed by a sharp increase. The contents of cell wall components such as protopectin, cellulose and semi-cellulose continuously decreased during storage, while water-soluble pectin dropped after an initial increase. Furthermore, the ultrastructure of the inner pericarp was damaged as indicated by the appearance of large holes. Aril breakdown index showed a highly signif i cant inverse correlation with ATP and ADP contentsand the contents of cell wall components (P ＜ 0.01), a highly signif i cant positive correlation with PG, PE and Cx activities(P ＜ 0.01), and a signif i cant inverse correlation with AMP level (P ＜ 0.05), but it had no signif i cant correlation with EC or β-Gal activity (P ＞ 0.05). In conclusion, combined treatment with calcium chloride and chitosan or heat could delay aril breakdown in grapes by maintaining the integrity of the cell membrane and high energy status, inhibiting the transformation of protopectin to water-soluble pectin, inhibiting the activities of cell wall-degrading enzymes (PG, PE and Cx), and suppressing the degradation of cell wall components (proto-pectin, cellulose and semi-cellulose), and chitosan coating was signif i cantly more effective than heat treatment (P ＜ 0.05).

grape fruit; aril breakdown; energy levels; ultrastructure; cell wall metabolism

10.7506/spkx1002-6630-201801040

TS255.3

A

1002-6630（2018）01-0264-09

張群, 周文化, 譚歡, 等. 葡萄果肉組織的能量水平和細(xì)胞壁代謝對其自溶軟化的影響[J]. 食品科學(xué), 2018, 39(1):264-272.

10.7506/spkx1002-6630-201801040. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Qun, ZHOU Wenhua, TAN Huan, et al. Effects of energy level and cell wall metabolism on aril breakdown in grape fruits[J]. Food Science, 2018, 39(1): 264-272. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201801040. http://www.spkx.net.cn

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004；2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南 長沙 410125）

2016-10-20

湖南省重點研發(fā)計劃（農(nóng)業(yè)支撐領(lǐng)域）項目（2015NK3027）

張群（1972—），女，研究員，博士研究生，研究方向為果蔬貯藏與加工。E-mail：zqun208@163.com

*通信作者簡介：周文化（1969—），男，教授，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：13786129879@126.com