唐秋琳 畢 鋒

·基礎(chǔ)研究·

鳥苷酸交換因子ARHGEF 10功能鑒定及其與腫瘤惡性表型間的關(guān)系研究

唐秋琳 畢 鋒

目的Dbl家族鳥苷交換因子(GEFs)是Rho家族蛋白發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的主要調(diào)控單位，它通過使Rho蛋白從無活性的GDP形式轉(zhuǎn)換為GTP形式的Rho蛋白而發(fā)揮作用。本研究對一個GEF分子-ARHGEF 10進(jìn)行了結(jié)構(gòu)和功能上的初步探究，對該分子在腫瘤發(fā)展過程中扮演的角色進(jìn)行討論。方法Realtime PCR對ARHGEF 10在人體42種正常組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了測定；GST-pulldown技術(shù)對ARHGEF 10的體內(nèi)GEF活性進(jìn)行了檢測；雙熒光素酶報告基因檢測技術(shù)對下游小分子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子活性檢測；應(yīng)用免疫熒光雙染標(biāo)記法完成了高表達(dá)ARHGEF 10對正常細(xì)胞骨架形態(tài)的影響；在細(xì)胞表型實(shí)驗(yàn)中分別使用CCK8法、Transwell法及軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測了高表達(dá)ARHGEF 10對細(xì)胞增殖侵襲遷移及體外成瘤能力的影響。結(jié)果生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示ARHGEF10分子量為156 kD，具有典型的Dbl家族分子結(jié)構(gòu)域，在肺組織中表達(dá)量最高，能夠促使正常成纖維細(xì)胞中的應(yīng)力纖維(Stress fiber)增多，同時促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲及克隆形成，體外轉(zhuǎn)錄因子活性檢測發(fā)現(xiàn)該基因可能與JAK/STAT通路有關(guān)。結(jié)論ARHGEF 10是一個典型的鳥苷交換因子家族分子，能激活Rho家族分子RhoA，具有明顯的癌基因特征。

鳥苷酸交換因子；ARHGEF 10；Dbl家族；Rho家族；癌基因

Rho家族GTP酶通過對細(xì)胞骨架的重組，控制著細(xì)胞遷移、浸潤和轉(zhuǎn)移；通過對細(xì)胞生長周期的調(diào)控與細(xì)胞的生長、分化相聯(lián)系，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，并且和腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Rho蛋白平時以無活性的GDP形式存在于細(xì)胞內(nèi)，在鳥苷酸交換因子(Guanine nucleotide exchange factors，GEFs)的作用下轉(zhuǎn)換為GTP形式的Rho蛋白從而發(fā)揮作用[1-2]。鳥苷酸交換因子中最重要的Dbl家族成員一般在結(jié)構(gòu)上均有一個由200個氨基酸組成的DH結(jié)構(gòu)域(Dbl homology domain)和一個緊隨其后的約有100個氨基酸組成PH結(jié)構(gòu)域(Pleckstrin homology domain)。

體外實(shí)驗(yàn)表明DH可以獨(dú)立完成Rho家族蛋白由GDP形式向GTP形式的轉(zhuǎn)化(即激活Rho家族蛋白)；PH的主要功能是將GEFs導(dǎo)向Rho家族蛋白豐富的細(xì)胞膜區(qū)。只有DH-PH一起才能引起細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[1-2]。因此，DH-PH即為Dbl家族成員基本的功能單位。正常情況下Dbl家族成員處于自我抑制狀態(tài)。它們一般在出現(xiàn)N末端或C末端截斷突變后被激活，進(jìn)而通過將Rho-GDP轉(zhuǎn)變?yōu)镽ho-GTP而激活Rho家族以控制細(xì)胞的生長發(fā)育和浸潤轉(zhuǎn)移等。

Dbl家族與腫瘤發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，例如Dbl癌基因發(fā)現(xiàn)于彌漫性B細(xì)胞淋巴瘤[3]，Ost來源于骨肉瘤[4]，Tiam-1來自T細(xì)胞淋巴瘤等[5]。從事相關(guān)領(lǐng)域研究的科學(xué)家認(rèn)為Dbl家族成員在許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能起著決定性的作用[6]。該家族在人類基因組計劃后被證實(shí)約有80個成員[7]，并不斷有新成員被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。本研究針對近年來被發(fā)現(xiàn)的GEF家族成員鳥苷酸交換因子10(Rho Guanine nucleotide exchange factor 10，ARHGEF 10)進(jìn)行序列和功能上的研究，闡述了其對GTPase的調(diào)控作用，ARHGEF 10能夠促進(jìn)細(xì)胞的惡性表型，屬于癌基因。

1 材料與方法

1.1 蛋白質(zhì)序列及生物信息學(xué)分析

ARHGEF 10的全長序列通過NCBI blastp檢索得到(GenBank：BAA20754.3)；ARHGEF 10的結(jié)構(gòu)功能域(Domain)分析是通過SMART[8]和PFAM2 3.0(Wellcome Trust Sanger Institute，Canbrige.UK)程序分析得到；ARHGEF 10與GEFs成員進(jìn)行多序列比對(Multiple alignment)，首先通過ClustalX 2.0軟件分析[9]，并用GeneDoc軟件[10]對aln結(jié)果進(jìn)行比對，通過計算distance matrix分析得到的進(jìn)化樹是用treeview[11]和MEGA4.1[12]程序聯(lián)合完成。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建

ARHGEF 10的cDNA克隆自人類表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)。ARHGEF 10-DHPH分別構(gòu)建至哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體pDest26-his及pRK5-myc。RhoA，Cdc42，Rac1通過PCR擴(kuò)增并構(gòu)建至pCMV-HA載體。pGEX-GST-PAK、pGEX-GST-mDia、pCEFL-GST-RhoAV14表達(dá)質(zhì)粒為Zheng教授饋贈(美國田納西州辛辛那提大學(xué)兒童醫(yī)學(xué)中心)。

1.3 抗體及試劑

Anti-HA抗體(1∶1 000，eBioscience)，anti-myc抗體(1∶1 000，Biolegend)，anti-GST抗體(1∶1 000，Cell Signaling)，rhodamine-phalloidin(羅丹明-鬼筆環(huán)肽，Sigma-Aldrich，St louis，Mo)，谷胱甘肽beads(Thermo Scientific，Rockford)，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen，CA)，IRDye 800CW驢抗兔/鼠IgG熒光二抗(H+L，LI-COR，Lincon)。

1.4 GST-Pull down

Rho家族蛋白活性檢測通過GST-Pull down實(shí)驗(yàn)完成，以mDia(GST-RBD)和PAK(GST-PBD)融合蛋白作為誘餌對RhoA、cdc42和Rac1進(jìn)行結(jié)合實(shí)驗(yàn)。GST融合蛋白轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli BL21，當(dāng)菌體OD值達(dá)到0.7～1.0，即以0.1 mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。ARHGEF 10-DHPH表達(dá)質(zhì)粒及空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，用RIPA細(xì)胞裂解液提取蛋白。細(xì)胞蛋白裂解液與GST beads結(jié)合蛋白孵育3 h后，以PBS+1% triton洗三次，PBS洗三次，SDS buffer重懸后，進(jìn)行Western blot SDS-page膠檢測。

1.5 Realtime PCR

Realtime PCR檢測ARHGEF 10在人不同組織中的表達(dá)情況。引物設(shè)計通過primer 6.0完成，通過對人類cDNA(48種包含第一鏈的人類主要組織；Human Rapid-Scan Plate，OriGene Technologies，Inc.，Rockville，MD)中目的基因ARHGEF 10進(jìn)行Realtime PCR擴(kuò)增。正向引物：5-GAGGTTCCCACAGTTCATCC-3，反向引物：5-GCTTGTTCAGGTATCTTTCGT-3；反應(yīng)體系為16.3 μL，包括600 nmol/L上下游引物，200 nmol/L探針，0.5單位Platinum SuperFiTMTaq聚合酶，200 μmol/L的dATP，dCTP，dGTP，dTTP及1×PCR buffer。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃15 s，57℃ 30 s，72℃ 1 min，40個循環(huán)。所得到數(shù)據(jù)使用iQ5 Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad)進(jìn)行分析。

1.6 免疫熒光檢測細(xì)胞骨架

以DMEM F12培養(yǎng)基及10%胎牛血清培養(yǎng)NIH3T3細(xì)胞，5%CO2，37℃下培養(yǎng)24 h。8 mm玻片用多聚賴氨酸處理后置于24孔板內(nèi)，接種NIH3T3，轉(zhuǎn)染ARHGEF 10-DHPH表達(dá)質(zhì)粒，48 h后，以多聚甲醛固定，1%triton-PBS破壁處理后，孵育一抗anti-myc，F(xiàn)ITC-標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體以及TRITC(四甲基異硫氰酸羅丹明)標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽后，于共聚焦顯微鏡下檢測。

1.7 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將轉(zhuǎn)染了ARHGEF 10-DHPH表達(dá)質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞NIH3T3分別以每孔400個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，按照Cell Counting Kit-8試劑盒要求檢測腫瘤細(xì)胞的增殖情況，并繪制生長曲線圖。

1.8 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

將轉(zhuǎn)染了ARHGEF 10-DHPH表達(dá)質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞NIH3T3接種于12孔培養(yǎng)板，形成細(xì)胞單層，每組平行4個樣本。用移液器滴頭沿培養(yǎng)板底部作一個寬度為0.8 mm左右的劃痕，鏡下記錄劃痕區(qū)相對距離，用無血清培養(yǎng)液洗滌，更換1%胎牛血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后更換10%胎牛血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察并照相。

1.9 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

將BD公司的Transwell小室放入24孔培養(yǎng)板中，在小室外加入混合的條件培養(yǎng)液和完全培養(yǎng)液；在小室內(nèi)分別加入實(shí)驗(yàn)組和對照組NIH3T3細(xì)胞，每組重復(fù)4個樣本。常規(guī)培養(yǎng)48 h，取出Transwell小室，PBS淋洗，用棉簽擦去微孔膜上層的細(xì)胞，無水乙醇固定，結(jié)晶紫染色。在顯微鏡下隨機(jī)挑取5個視野計數(shù)穿膜的細(xì)胞數(shù)，取每個視野的平均數(shù)表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

1.10 軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)

將低熔點(diǎn)瓊脂糖與細(xì)胞培養(yǎng)基混合制備底層瓊脂，于孔板中溫室凝固；取轉(zhuǎn)染組及對照組NIH3T3對數(shù)期細(xì)胞，胰酶消化后吹散成單個細(xì)胞懸液并計數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2 500個/孔；將低熔點(diǎn)瓊脂糖與細(xì)胞培養(yǎng)基混合制備上層瓊脂，每孔加上層瓊脂和單細(xì)胞懸液，混勻，室溫凝固。于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周，計數(shù)含50個細(xì)胞以上的克隆，計算細(xì)胞集落形成率，DAPI染色，顯微鏡下計數(shù)，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.11 雙熒光素酶報告基因檢測

將目的基因、下游小分子轉(zhuǎn)錄因子(Luciferase)、內(nèi)參(PRL-TK)按照一定比例共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，37℃培養(yǎng)48 h后，以陽性裂解液(Promega)裂解細(xì)胞，輕柔搖動20 min，混勻后使用LI-COR synergy system進(jìn)行檢測。螢火蟲熒光素酶檢測轉(zhuǎn)錄因子活性，海腎熒光素酶檢測內(nèi)參PRL-TK活性，pTA為空白對照。

1.12 統(tǒng)計學(xué)分析

用GraphPad Prims 5.0軟件及SPSS17.0軟件進(jìn)行作圖及統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布使用單因素方差分析和雙因素方差分析，多重比較使用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對ARHGEF 10的生物信息學(xué)分析

SMART軟件對ARHGEF 10 分子進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示，ARHGEF 10基因大小為4215 bp，表達(dá)后蛋白分子為156 kD，具有Dbl家族癌基因特有的順序排列的相對保守的功能區(qū)：RhoGEF結(jié)構(gòu)域，屬于Dbl家族成員，此外，該分子還具有將蛋白錨定到細(xì)胞膜上的PH結(jié)構(gòu)域，是一個結(jié)構(gòu)上典型的Dbl家族成員(圖1A，B)；進(jìn)一步對ARHGEF 10基因及其他典型Dbl家族分子進(jìn)行序列比對，該部分采用ClustalW軟件基于兩兩比對漸進(jìn)的多重序列比對方法對其進(jìn)行同源分析，結(jié)果顯示ARHGEF 10與Dbl家族其他成員的同源性水平較低，揭示ARHGEF 10在具有DH-PH基本功能域的同時，可能還具有與其他GEFs不同的調(diào)控機(jī)制(圖1C)。

2.2 ARHGEF 10在正常組織中的表達(dá)檢測

使用SYRB Realtime-PCR檢測ARHGEF 10在人48種正常組織中的表達(dá)情況。以乳腺組織為對照進(jìn)行表達(dá)差異的比較。ARHGEF 10在小腸、肺、胃、子宮和陰道中的表達(dá)較高，其中肺中的表達(dá)最高。在食管、腎、肝、外周血白細(xì)胞、乳腺、肌肉、鼻黏膜、甲狀腺、舌和腭垂中的表達(dá)較低，其中在肌肉和卵巢中基本不表達(dá)(圖2)。

2.3 ARHGEF 10主要通過RhoA發(fā)揮其調(diào)控作用

GST-Pull down實(shí)驗(yàn)顯示，ARHGEF 10-DHPH可以在體內(nèi)與激活的RhoA、Rac1、Cdc42結(jié)合，具有GEF活性，但其與RhoA的結(jié)合最為明顯(圖3A)。此外在對轉(zhuǎn)染ARHGEF 10-DHPH的NIH3T3細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光雙染后發(fā)現(xiàn)，表達(dá)ARHGEF 10-DHPH的細(xì)胞中細(xì)胞骨架的應(yīng)力纖維(Stress fiber)呈現(xiàn)明顯的增多趨勢，提示ARHGEF 10主要激活小G蛋白家族的RhoA，從而調(diào)控細(xì)胞骨架中應(yīng)力纖維的增多(圖3B)。從上述兩個實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推斷，ARHGEF 10主要通過激活RhoA從而發(fā)揮GEF的功能。

圖1 生物信息學(xué)方法對ARHGEF10的序列分析Figure 1 Sequence analysis of ARHGEF10 by bioinfomatics methodsNote：A.The full-length sequence of ARHGEF 10 protein；B.Domains of ARHGEF 10(SMART software)；C.ARHGEF 10 and Dbl family members multiple sequence alignment and phylogenetic tree.

圖2 ARHGEF 10在人48種組織樣本中表達(dá)情況Figure 2 The mRNA expression of ARHGEF 10 in 48 human tissue samples Note：According to the Ct values to calculate the relative expression.

圖3 檢測ARHGEF 10對Rho家族成員的激活情況Figure 3 ARHGEF 10 activation members of Rho familyNote：A.ARHGEF 10 activates the Rho family of small G proteins in vivo by Pull-Down assay；B.The effect of ARHGEF 10 on the cytoskeleton of mouse NIH3T3 fibroblasts was detected by immunofluorescence.(a.Cytoskeleton labeled with TRITC-phalloidin；b.Cells transfected and expressed pRK5-myc-ARHGEF-DHPH).

2.4 ARHGEF 10對細(xì)胞惡性表型的影響

2.4.1 ARHGEF 10對NIH3T3細(xì)胞增殖的影響 使用CCK-8法測定分別轉(zhuǎn)染了ARHGEF 10-DHPH及Dbl-DHPH的NIH3T3細(xì)胞生長曲線，結(jié)果顯示兩組細(xì)胞在相同時間周期內(nèi)，生長速率較接近，而與轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞相比，生長速度明顯增加。通過兩因素重復(fù)檢測方差分析得到，轉(zhuǎn)染ARHGEF 10的實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，其細(xì)胞增殖速率明顯增加，與轉(zhuǎn)染陽性對照質(zhì)粒組趨勢一致，實(shí)驗(yàn)組與細(xì)胞培養(yǎng)時間之間有交互效應(yīng)，隨著細(xì)胞培養(yǎng)時間增加，細(xì)胞數(shù)明顯增多，以陽性對照組(Dbl-DHPH)增加最多，具有統(tǒng)計學(xué)意義。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明上調(diào)ARHGEF 10的表達(dá)可以明顯促進(jìn)成纖維細(xì)胞NIH3T3細(xì)胞的增殖速率(圖4C)。

2.4.2 ARHGEF 10對細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響 應(yīng)用Matrigel基質(zhì)膠包被的transwell小室觀察細(xì)胞的體外侵襲能力，我們發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了ARHGEF 10-DHPH的NIH3T3細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)明顯多于轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞，同時以轉(zhuǎn)染Dbl-DHPH的細(xì)胞作為陽性對照(圖4A，B)；然而劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻顯示，轉(zhuǎn)染ARHGEF 10-DHPH細(xì)胞的遷移能力與轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞相比，沒有明顯的變化，細(xì)胞遷移率明顯低于轉(zhuǎn)染了Dbl-DHPH的陽性對照組細(xì)胞(圖4D)。以上結(jié)果顯示ARHGEF 10表達(dá)上調(diào)會增加細(xì)胞侵襲能力，但是對細(xì)胞遷移能力沒有明顯作用。

2.4.3 ARHGEF 10對細(xì)胞體外成瘤能力的影響 在體外軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)中，我們以低熔點(diǎn)瓊脂糖作為基質(zhì)模擬體內(nèi)環(huán)境，對轉(zhuǎn)染了ARHGEF 10-DHPH的NIH3T3細(xì)胞進(jìn)行了成瘤能力的研究。結(jié)果顯示，與空白對照組(轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞)相比，轉(zhuǎn)染了ARHGEF 10-DHPH的細(xì)胞具有明顯的克隆形成能力，與陽性對照轉(zhuǎn)染Dbl-DHPH細(xì)胞的克隆形成能力相當(dāng)(圖5)。該實(shí)驗(yàn)說明ARHGEF 10具有明顯的細(xì)胞體外成瘤能力。

2.5 雙熒光素酶報告基因檢測ARHGEF 10對轉(zhuǎn)錄因子活性的影響

選取293T細(xì)胞系，以空載pDest26作為空白(陰性)對照，pDest26-Dbl-DHPH作為陽性對照，通過雙熒光素酶報告基因(螢火蟲熒光素酶及海腎熒光素酶)檢測，對共轉(zhuǎn)ARHGEF 10-DHPH，pRL-TK(海腎熒光素酶，內(nèi)參)及下游效應(yīng)分子(7種轉(zhuǎn)錄因子，及空白對照pTA)的胞內(nèi)熒光素酶活性進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，結(jié)合空白及陽性對照組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，ARHGEF 10對pIRSE報告基因活性有明顯上調(diào)作用，提示該分子可能與JAK/STAT信號通路有關(guān)(圖6)。

圖4 ARHGEF 10對細(xì)胞惡性表型的影響Figure 4 Effects of ARHGEF 10 on cell malignant phenotypeNote：A and B.The effect of ARHGEF 10 on invasion of NIH3T3 cells；C.The effect of ARHGEF 10 on proliferation of NIH3T3 cells；D.The effect of ARHGEF 10 on migration of NIH3T3 cells.

圖5 ARHGEF 10對細(xì)胞體外成瘤能力的影響Figure 5 Effects of ARHGEF 10 on tumorigenic ability in vitro

圖6 ARHGEF 10對下游小分子轉(zhuǎn)錄因子活性的影響Figure 6 The effects of ARHGEF 10 on the activity of downstream small molecule transcription factors

4 討論

鳥苷酸交換因子(GEFs)家族可以激活下游的Rho家族蛋白從而引起細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)化、侵襲和轉(zhuǎn)移[7]，是典型的癌基因家族。從事相關(guān)領(lǐng)域研究的科學(xué)家認(rèn)為Dbl家族成員在許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能起著決定性的作用[7]。近些年來，不斷有新的Dbl家族分子陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)并報道，2007年，一個與Dbl家族成員VAV3具有高同源性的新GEF分子-EhGEF3被發(fā)現(xiàn)，研究指出該分子對RhoA和Rav1具有很強(qiáng)的GEF活性[13]；2016年，一個能夠調(diào)控Rab家族成員Rab11的GEFs-REL1被發(fā)現(xiàn)，該新GEFs能夠通過調(diào)節(jié)Rab11的定位從而影響細(xì)胞周期[14-15]。然而，對新的Dbl分子的研究不應(yīng)僅僅停留在其GEF活性的研究上，對于此類分子的調(diào)控機(jī)制及具體作用位點(diǎn)的研究，是進(jìn)一步揭示其作用機(jī)理的重要途徑，比如，一個新的Dbl家組成員P63RhoGEF活性調(diào)控機(jī)制，最早研究發(fā)現(xiàn)該基因序列中只含有DHPH功能域[16]，發(fā)現(xiàn)其與Gαq蛋白功能亞基具有相互結(jié)合作用，并能上調(diào)其GEF活性，同時發(fā)現(xiàn)PH域?qū)ζ銰EF活性存在抑制作用[17]。之后Rojas等人對其活性調(diào)控機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，在其PH結(jié)構(gòu)域后方存在一個保守序列[18]，并由此推測了該序列的空間結(jié)構(gòu)；Lutz等人由此最終得到Gq蛋白、p63RhoGEF及RhoA的復(fù)合物的空間結(jié)構(gòu)[19]。

在人類基因組計劃完成后，發(fā)現(xiàn)了許多重要的Dbl家族癌基因，本研究針對其中一個尚未深入研究的GEFs-ARHGEF 10進(jìn)行了結(jié)構(gòu)及功能上的分析，對其在Dbl家族中的地位有了進(jìn)一步的認(rèn)識；細(xì)胞內(nèi)GEF活性測定結(jié)果顯示，該基因?qū)ho家族幾個具有代表性的分子(RhoA，cdc42，Rac1)均有一定的激活作用；在用免疫熒光法檢測ARHGEF 10對細(xì)胞骨架的影響中，我們發(fā)現(xiàn)高表達(dá)ARHGEF 10-DHPH的NIH3T3細(xì)胞具有明顯的形成Stress fiber的能力，而Stress fiber的形成與RhoA的激活具有顯著的關(guān)聯(lián)性，此發(fā)現(xiàn)也進(jìn)一步證明了ARHGEF 10對RhoA具有激活作用。Rho家族小分子的確定也明確了ARHGEF 10在信號通路中下游的關(guān)鍵作用位點(diǎn)，為進(jìn)一步展開其活性調(diào)控機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)控是信號通路研究中的關(guān)鍵，我們選取7個信號通路研究中常見的轉(zhuǎn)錄因子，通過ARHGEF 10對其轉(zhuǎn)錄因子活性檢測后發(fā)現(xiàn)，myc，ISRE的轉(zhuǎn)錄因子活性受到明顯上調(diào)。myc基因是一類已知的癌基因，以往的研究中發(fā)現(xiàn)c-myc基因位點(diǎn)與Ig基因位點(diǎn)之間的易位會使c-myc易位到高活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，從而組成一個高轉(zhuǎn)錄活性的重排基因，啟動c-myc轉(zhuǎn)錄，使c-myc表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞惡變，最后導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[20]。目前認(rèn)為胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、何杰金氏病及頭部腫瘤等都有myc基因的擴(kuò)增或過度表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示ARHGEF 10可能與myc基因易位有著某種聯(lián)系，從而通過myc上調(diào)改變細(xì)胞周期，引起細(xì)胞惡性增殖。另外，ARHGEF 10對ISRE及STAT3的上調(diào)結(jié)果也提示，ARHGEF 10可能與JAK-STAT通路及誘導(dǎo)MHCI類分子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)存在某種關(guān)聯(lián)[21]，從而參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等許多重要的生物學(xué)過程，但具體的傳導(dǎo)通路還有待進(jìn)一步研究，總之，對轉(zhuǎn)錄因子活性的研究對于我們找尋治療癌癥的重要藥物靶點(diǎn)提供了可靠的理論依據(jù)。

近年有部分關(guān)于ARHGEF 10的研究報道，發(fā)現(xiàn)ARHGEF 10的N末端(1-322aa)屬于功能負(fù)調(diào)控區(qū)，322位氨基酸突變后會引起對RhoA的活性增加以及減慢神經(jīng)傳導(dǎo)速度的變化，并針對神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行了其機(jī)制的探討[22]，另有報道發(fā)現(xiàn)，ARHGEF 10中包含一個WD40類似的結(jié)構(gòu)域及2個跨膜片段，具有典型的RhoB活性并能在NIH3T3細(xì)胞中誘導(dǎo)肌動蛋白纖維的生成，是一個特定的Rho-GEF家族的成員[23]。該結(jié)論與我們的研究結(jié)果有部分一致之處，但是并沒有針對與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的研究與意義展開討論，因此，本研究為ARHGEF 10進(jìn)一步應(yīng)用于臨床抗腫瘤治療奠定理論基礎(chǔ)，在我們的后續(xù)研究中，將確定該基因的腫瘤特異性，并將進(jìn)一步探索ARHGEF 10在腫瘤細(xì)胞中的分子調(diào)控機(jī)制，對于全面了解腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要的意義。

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IdentificationofguaninenucleotideexchangefactorARHGEF10anditsrelationshipwithtumormalignantphenotype

TANGQiulin，BIFeng

Department of Laboratory Molecular Targeted Therapy of Tumor and Medical Oncology，West China Hospital，Sichuan University，Chengdu 610041，China

ObjectiveThe guanine exchange factors(GEFs)of Dbl family is a major regulatory unit for the malignant transformation of Rho family proteins.It plays a role by converting Rho protein from inactive GDP form to GTP form of Rho protein.In this paper，we discuss the structure and function of a GEF molecule-ARHGEF 10，and discuss its role in the process of tumor development.MethodsThe expression of ARHGEF 10 in 42 normal tissues was measured by Real-Time PCR.GST-pulldown technique was used to detect the GEF activity of ARHGEF 10 in vivo.The transcription factor activity of downstream small molecules was detected by dual-luciferase report gene assay.The high expressive effect of ARHGEF 10 on normal cytoskeleton morphology was performed by dual immunofluorescence staining labeling method.High expressive effects of ARHGEF 10 on cell proliferation，invasion and tumorigenic ability in vitro were examined using CCK8，Transwell and soft agar clony formation assays.ResultsARHGEF 10 has a typical GEFs structure，which binds to RhoA in vitro and promotes the proliferation and invasion of NIH3T3 cells，and has significant ability to clone in vitro.ConclusionARHGEF 10 is a typical family molecule of guanosine exchange factor that activates RhoA of Rho family，which has obvious oncogene characteristics.

Guanine nucleotide exchange factors；ARHGEF 10；Dbl；Rho GTPases；Oncogene

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81572731)；國家重點(diǎn)研發(fā)計劃重點(diǎn)專項(xiàng)項(xiàng)目(2016YFC1303203)

四川大學(xué)華西醫(yī)院腫瘤分子靶向治療研究室及腫瘤中心(成都 610041)

唐秋琳，女，(1981-)，碩士，實(shí)驗(yàn)師，從事腫瘤細(xì)胞生物學(xué)的研究。

唐秋琳，E-mail：tangqiulin1981@163.com

R730.2

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.06.001

(收稿：2017-06-26)