劉國慧 谷安鑫 殷洪濤 曹 陽 賀云龍 王春波 鄂明艷

原蘇木素A對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞系放療增敏作用的研究

劉國慧 谷安鑫 殷洪濤 曹 陽 賀云龍 王春波 鄂明艷

目的本研究將原蘇木素A、蘇木醇提物、順鉑分別與放療聯(lián)合作用于胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞系，研究原蘇木素A是否增加胃癌SGC-7901細(xì)胞系放射敏感性，為臨床用藥開創(chuàng)更新的領(lǐng)域。方法體外培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞系，以蘇木醇提物、順鉑為對(duì)照，MTT法檢測(cè)原蘇木素A對(duì)細(xì)胞增殖作用的影響，以及其與作用濃度和作用時(shí)間的關(guān)系；采用克隆形成實(shí)驗(yàn)，擬合細(xì)胞存活曲線，以單純放療組為對(duì)比，計(jì)算放射增比(SER)，分析原蘇木素A的增敏效果。結(jié)果原蘇木素A對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901有生長抑制作用，但抑制作用相對(duì)較弱，其細(xì)胞毒性有明顯的時(shí)間和濃度依賴性。不同作用時(shí)間及作用濃度下的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的改變?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)顯示原蘇木素A顯著增加了SGC-7901細(xì)胞的放射敏感性，與單純放射組對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論原蘇木素A對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制有濃度和時(shí)間的依賴性，聯(lián)合放射治療能夠提高放射增敏作用，兩者可能具有協(xié)同抗腫瘤作用。

原蘇木素A；蘇木醇提物；胃癌；放射治療；放射敏感性

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率高居全球惡性腫瘤的前4位。我國是胃癌高發(fā)區(qū)，2015年我國胃癌的發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤的第2位[1]。目前，治愈胃癌的主要方法為根治性手術(shù)，然而根治術(shù)后區(qū)域局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移則成為治療失敗的主要原因。因此，術(shù)前的放療、新輔助化療及術(shù)后的同步放化療等圍手術(shù)期的輔助治療越顯關(guān)鍵。最近幾年，胃癌的放射治療在不斷探索中由開始的姑息性治療轉(zhuǎn)變?yōu)檩o助治療。近年來，逐漸形成以手術(shù)治療為基礎(chǔ)，以化療、放療、靶向治療、熱灌注治療等一系列治療為輔的綜合治療模式[2]。

蘇木(Caesal Piia SappanL，cAE)屬于一種來源于豆科云實(shí)屬植物的干燥心材?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有抗腫瘤、免疫抑制等作用，臨床上也用于腫瘤的治療[3]。研究發(fā)現(xiàn)，cAE提純的重要活性成分可對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖呈現(xiàn)抑制作用、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡、對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移有抑制作用；與部分化學(xué)藥物聯(lián)合，可明顯提高療效，同時(shí)具有無明顯血液系統(tǒng)毒性、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥和提高機(jī)體免疫力等作用[4]。臨床及體外實(shí)驗(yàn)證明，蘇木提純物對(duì)包括肺癌、結(jié)腸癌、胃癌、肝癌等多系統(tǒng)腫瘤具有不同程度的抗腫瘤作用[5-6]。基于蘇木提純物具有多“靶點(diǎn)”抗腫瘤作用，為明確其單體成分原蘇木素A是否為主要抗腫瘤成分，及其對(duì)放療是否有增敏效應(yīng)。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)研究證明原蘇木素A對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用及對(duì)胃癌放射的增敏作用，為進(jìn)一步開展原蘇木素A與放療聯(lián)合應(yīng)用于胃癌的臨床治療奠定理論基礎(chǔ)，并為將來臨床中藥治療腫瘤的提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

人胃癌SGC-7901細(xì)胞系由黑龍江省腫瘤防治研究所提供。細(xì)胞使用含10%新生牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。原蘇木素A由黑龍江大學(xué)生化中心提供。蘇木95%醇提物由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥理學(xué)系研制并提供。順鉑為江蘇奧賽生產(chǎn)。

1.2 放射條件

放射源為哈醫(yī)大附屬腫瘤醫(yī)院放療科Elektasynergy直線加速器，能量為4 MeV，劑量率300 cGy/分。照射野充分覆蓋培養(yǎng)瓶，照射時(shí)將培養(yǎng)瓶細(xì)胞面朝上放置，并墊1 cm厚組織補(bǔ)償膜。

1.3 MTT增殖抑制實(shí)驗(yàn)

將原蘇木素A用DMSO配制成濃度：100 μM，200 μM，400 μM，800 μM，1600 μM；蘇木醇提物用PBS稀釋成濃度：50 μg/mL，100 μg/mL，200 μg/mL。順鉑稀釋成濃度為：2 μg/mL，3 μg/mL，5 μg/mL，10 μg/mL。細(xì)胞計(jì)數(shù)后將細(xì)胞懸液稀釋為1×104/mL，按每孔5 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積約100 μL，每個(gè)劑量點(diǎn)設(shè)4個(gè)復(fù)孔，設(shè)對(duì)照組(僅加培養(yǎng)液，不加細(xì)胞)，分別加入相應(yīng)濃度的原蘇木素A、蘇木素醇提物及順鉑純品的培養(yǎng)液，放回培養(yǎng)箱，按培養(yǎng)24 h、48 h及72 h的藥物作用時(shí)間，相應(yīng)時(shí)間取出96孔板，在避光條件下每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO，搖床上低速振蕩10 min使結(jié)晶物充分融合比色。選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔的吸光度(OD)值，同時(shí)設(shè)置對(duì)照孔，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

1.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)

將培養(yǎng)瓶中指數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞消化、離心后，制成單細(xì)胞懸液，并按梯度稀釋成不同濃度，根據(jù)各個(gè)劑量點(diǎn)需接種的細(xì)胞數(shù)將細(xì)胞接種于25 cm培養(yǎng)瓶中，設(shè)0、2、4、6、8、10 Gy劑量點(diǎn)，每個(gè)劑量點(diǎn)設(shè)置4個(gè)培養(yǎng)瓶，并分成原蘇木素A組、蘇木醇提物組、順鉑組及對(duì)照組。細(xì)胞接種后約12 h更換培養(yǎng)液，根據(jù)MTT檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算原蘇木素A 400 μM時(shí)藥物濃度為196.2 μg/μL，原蘇木素A 800 μM時(shí)藥物濃度為392.4 μg/μL，蘇木95%醇提物50 μg/mL時(shí)藥物濃度為90 μM，順鉑2 μg/mL時(shí)藥物濃度為144 μM。更換培養(yǎng)液后，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行照射，照射后繼續(xù)培養(yǎng)10～14天，甲醛固定，結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)>50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。計(jì)算貼壁率及各劑量點(diǎn)細(xì)胞存活率：貼壁率=對(duì)照組克隆數(shù)/種植細(xì)胞數(shù)×100%；存活率=(實(shí)驗(yàn)組克隆數(shù)/種植細(xì)胞數(shù)×貼壁率)×100%；克隆形成率(PE)=克隆數(shù)/接種的細(xì)胞數(shù)。根據(jù)上述計(jì)算所得結(jié)果按多靶單擊方程SF擬合細(xì)胞存活曲線，計(jì)算增敏比(SER值)，上述實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次重復(fù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 19.0軟件，MTT增殖抑制實(shí)驗(yàn)測(cè)定三種藥物濃度和時(shí)間與SGC-7901細(xì)胞存活率的關(guān)系曲線，克隆形成實(shí)驗(yàn)選取多個(gè)劑量點(diǎn)來評(píng)估細(xì)胞放射生物學(xué)特征，以此利用單擊多靶模型SF=1-(1-e-D/D0)N估計(jì)增敏效應(yīng)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原蘇木素A和蘇木醇提物對(duì)SGC-7901細(xì)胞的生長抑制作用

MTT實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)不同濃度的原蘇木素A、蘇木醇提物、順鉑分別作用24 h、48 h、72 h后對(duì)SGC-7901細(xì)胞的生長抑制情況，以觀察藥物濃度和作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞存活率的影響(圖1)。通過計(jì)算原蘇木素A細(xì)胞抑制率，可以看出在相同作用時(shí)間下，作用24 h時(shí)，原蘇木素A組最大濃度1 600 μM的細(xì)胞抑制率為最小濃度100 μM的-0.99倍；作用48 h時(shí)，最大濃度細(xì)胞抑制率為最小濃度的2.12倍；作用72 h時(shí)，最大濃度細(xì)胞抑制率為最小濃度的3.15倍。在相同濃度下，低濃度原蘇木素A100 μM 72 h的細(xì)胞抑制率為24 h的2.61倍；高濃度1 600 μM 72 h的細(xì)胞抑制率為24 h的8.23倍；由此分析出原蘇木素A對(duì)SGC-7901細(xì)胞抑制率呈明顯的時(shí)間和濃度依賴性(表1，圖2)。通過計(jì)算，得出原蘇木素A 24 h半數(shù)生長抑制濃度為1965 μmol/L，72 h為119 μmol/L，其中不同組別半數(shù)生長抑制濃度IC50對(duì)比見表2。進(jìn)一步分析出三種藥物對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制作用為順鉑>蘇木醇提物>原蘇木素A。

圖1 MTT法測(cè)定三種藥物濃度和時(shí)間與SGC-7901細(xì)胞存活率的關(guān)系曲線Figure 1 Relationship between survival rates and doses of three drugs in SGC-7901 cells for different time-point treatmentsNote：The logarithmic-effect curve respectively Protosappanin A(A)Caesalpinia Sappan L Extract(B)Cisplatin(C)that acting on 24 h，48 h and 72 h.

表1 MTT法測(cè)定三種藥物不同作用劑量及時(shí)間的平均抑制率Table 1 The average inhibitory rates of three drugs in SGC-7901 cells for different time-point treatments

表2 MTT法測(cè)定三種藥物不同作用時(shí)間的半數(shù)抑制濃度Table 2 Median concentration of three drugs in SGC-7901 cells

Note：IC50：Median inhibitory concentration；P<0.05.

圖2 原蘇木素A對(duì)細(xì)胞抑制率關(guān)系曲線圖Figure 2 Inhibitory rates of Protosappanin A in SGC-7901 cells

2.2 原蘇木素A放射增敏作用

根據(jù)克隆形成實(shí)驗(yàn)擬合出SGC-7901的細(xì)胞存活曲線(圖3)。結(jié)果表明，單純接受400 μM及800 μM原蘇木素A孵育24 h后，細(xì)胞的貼壁率與對(duì)照組無顯著性差異，但在分別接受了2、4、6、8、10 Gy的劑量照射后，原蘇木素A孵育組細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)隨放射劑量的增加明顯下降。細(xì)胞存活曲線的生物學(xué)參數(shù)見表3。通過與單純放療組做對(duì)比，計(jì)算出原蘇木素A高劑量組的增敏比為1.29。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明三種藥物對(duì)SGC-7901細(xì)胞的放射增敏作用為原蘇木素A 800 μM>順鉑>原蘇木素A 400 μM>蘇木醇提物。

圖3 聯(lián)合作用組和對(duì)照組SGC-7901細(xì)胞的存活曲線Figure 3 Survival curves of SGC-7901 cells treated with PrA with radiotherapyNote：R：Radiotherapy alone；AR(HP+R)：High dose of PrA with radiotherapy；BR(P+R)：Cisplatin with radiotherapy；CR(LP+R)：Low dose of PrA with radiotherapy；DR(E+R)：Caesalpinia Sappan L Extract with radiotherapy.

表3 聯(lián)合作用組和對(duì)照組SGC-7901細(xì)胞存活曲線的相關(guān)參數(shù)Table 3 Parameters of drug combined with radiotherapy in SGC-7901 cells

Note：P=0.04.D0：Mean lethal dose；Dq：Quasithreshold dose；D37：the corresponding radiation dose that the cell survival rate was 37%；SF2：Surviving fraction at 2 Gy；SER：Sensitivity enhancement ratio.

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年胃癌發(fā)生在中國的新發(fā)病例高達(dá)40%以上[7]，雖然手術(shù)及術(shù)后的放化療可以改善患者的預(yù)后，新一代化療藥物也不斷涌現(xiàn)，放療技術(shù)不斷進(jìn)步，但是放化療的5年生存率仍無顯著提高[8]，因此尋找新的有效治療策略勢(shì)在必行。

隨著放射治療技術(shù)的發(fā)展，以及化療藥物的不斷更新，放/化綜合治療也在不斷進(jìn)步，其理論基礎(chǔ)就是基于兩者的空間協(xié)同作用，即放射治療針對(duì)局部和區(qū)域病變，而化療作為全身治療能夠殺滅或控制轉(zhuǎn)移病變[9-10]。但是，放、化同時(shí)進(jìn)行，也會(huì)增加全身毒性或局部毒性反應(yīng)，當(dāng)今抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點(diǎn)可追隨于應(yīng)用中草藥研究療效高、低毒性的抗腫瘤藥物[11]。蘇木素在多種實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)有抗腫瘤作用，但是是何種成分起到主要的抗腫瘤作用尚未清楚[12-14]。因此為研究其成分原蘇木素A對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用及是否有放射增敏效果，本研究以人胃癌SGC-7901細(xì)胞系為主要研究對(duì)象，進(jìn)行了相關(guān)研究。通過MTT實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)原蘇木素A對(duì)SGC-7901細(xì)胞的生長抑制作用較弱，最大藥物濃度的抑制率不超過30%，這至少說明原蘇木素A對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞的抗腫瘤作用較弱。但隨著作用時(shí)間的增加，抑制率逐漸增加。MTT染色后，孔板底部可見少量的藍(lán)紫色結(jié)晶物質(zhì)，且隨著時(shí)間的推移及劑量的增加，藍(lán)紫色逐漸變淺，這也說明藥物作用后該細(xì)胞系呈現(xiàn)出明顯的抑制作用，上述觀察結(jié)果均表明原蘇木素A作用于SGC-7901細(xì)胞上的抑制作用有時(shí)間依賴性和濃度依賴性。本研究結(jié)果也說明，單獨(dú)使用原蘇木素A的抗腫瘤作用較弱，不適合作為獨(dú)立的治療藥物，而應(yīng)用于放化療聯(lián)合，會(huì)增加放化療的殺傷作用。

通過放射生物學(xué)測(cè)定腫瘤干細(xì)胞增殖能力的有效方法常為克隆形成實(shí)驗(yàn)，這種由單個(gè)細(xì)胞不斷復(fù)制形成的細(xì)胞群體稱為克隆或集落[15]。通過克隆形成實(shí)驗(yàn)我們選取多個(gè)劑量點(diǎn)來評(píng)估細(xì)胞放射生物學(xué)特征，以此利用單擊多靶模型SF=1-(1-e-D/D0)N估計(jì)增敏效應(yīng)[16]。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果顯示接受400 μM及800 μM原蘇木素A孵育24 h后，細(xì)胞的貼壁率與對(duì)照組無顯著性差異，但在接受了2～10 Gy的劑量照射后，原蘇木素A孵育組細(xì)胞的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)明顯下降。放射抗拒的SGC-7901細(xì)胞在大劑量原蘇木素A作用后，其放射敏感性增加，800 μM放射增敏比為1.29。評(píng)判某種增敏方法效能的大小，通常是通過增敏比(SER)來衡量的，如有增敏效果，則指標(biāo)結(jié)果SER>1.0(P<0.05)，增敏效果越明顯，其數(shù)值越大[17]。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明三種藥物對(duì)SGC-7901細(xì)胞的放射增敏作用為原蘇木素A 800 M>順鉑>原蘇木素A 400 μM>蘇木醇提物。因此說明原蘇木素A對(duì)SGC-7901細(xì)胞系的克隆源性細(xì)胞的抑制作用較弱，但通過放射敏感性的增加使腫瘤細(xì)胞存活減少。

綜上所述，本研究通過胃癌SGC-7901細(xì)胞的體外研究，證實(shí)了原蘇木素A對(duì)胃癌細(xì)胞放射增敏的作用，其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。因順鉑為常用化療藥物，但其毒副作用較大，而原蘇木素A為蘇木素提取成分，其生物活性廣，低毒，因此是否可以替代細(xì)胞毒類化學(xué)藥物，廣泛應(yīng)用于臨床作為放射增敏劑尚需通過臨床試驗(yàn)研究。

1 Chen W，Zheng R，Baade PD，et al.Cancer statistics in China，2015[J].CA Cancer J Clin，2016，66(2)：115-132.

2 季加孚.我國胃癌防治研究三十年回顧[J].中國腫瘤臨床，2013，40(22)：1345-1351.

3 徐建國，郭素堂，喬麗娟，等.蘇木提取液抑制腫瘤作用的研究[J].腫瘤研究與臨床，2006，11(3)：726-728.

4 張靜文.蘇木藥理作用研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2008，16：234-237.

5 歐陽波.蘇木化學(xué)成分研究[D].上海：中國科學(xué)院上海藥物研究所，2002：17-21.

6 Zuo GY，Han ZQ，Han J，et al.Antimicrobial activity and synergy of antibiotics with two biphenyl compounds，protosappanins A and B from Suppuu Liguum against methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains[J].J Pharm Pharmacol，2015，67(10)：1439-1447.

7 Parkin DM，Bray F，F(xiàn)eraly J，et al.Global cancer statistics，2002[J].CA Cancer J Clin，2005，55(2)：74-108.

8 舒詩會(huì)，張莉，杜冠華，等.蘇木的化學(xué)成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2007，19(1)：63-66.

9 Kim EC，Hwang YS，Lee HJ，et al.Caesalpinia sappan induces cell death by increaming the expression of P53 and P21WAF1/CIPI in head and neck cancer cells[J].Am J Chin Med，2005，33(3)：405-414.

10 Jemal A，Siegel R，Xu J，et al.Cancer statistics，2010[J].CA Cancer J Clin，2010，60(5)：277-300.

11 Tian T，Zhang PT，Yu MW，et al.Effect of hematoxylin in C57BL/6 mice with Lewis lung cancer growth and metastasis of different times[J].Chin J Integr Med，2010，30(7)：733-737.

12 Qiao LJ，Xu JG，Guo WJ，et al.Experimental study of the active ingredient of anti-cancer hematoxylin transplanted hepatoma H22[J].Hainan Medicine，2001，12(7)：51-52.

13 Tian T，Zhang PT.Experimental study of bone marrow hematoxylin CK18 CK19 expression on C57/BL6 tumor-bearing mice[J].Beijing Chinese Medicine，2010，29(3)：222-224.

14 Lange H.An overview of cancer multidurg resistance：a still unsolved problem[J].Cell Mol Life Sci，2008，65(20)：3145-3167.

15 Gillet JP，Efferth T，Reamacle J，et al.Chemotherapy-induced resistance by ATP-binding cassette transporter genes[J].Biochim Biophys Acta，2007，1775(2)：237-262.

16 Marchi N，Gonzalez-Martinez J，Njuyen MT，et al.Transporters in drug-refractory epilepsy；clinical significance[J].Clin Pharmacol Ther，2010，87(1)：13-15.

17 Tao LY，Li JY.Research ABCB1-mediated multidrug resistance activity inhibits oxidation hematoxylin[J].Liaoning Medical Journal，2011，32(3)：217-220.

ProtosappaninAincreasesthesensitivityofgastriccancerSGC-7901cellstoradiotherapy

LIUGuohui，GUAnxin，YINHongtao，CAOYang，HEYunlong，WANGChunbo，EMingyan

Department of Radiation Oncology，Harbin Medical University Cancer Hospital，Harbin 150081，China

ObjectiveIn this study，Protosappanin A，Caesalpinia Sappan L extract and Cisplatin were combined with radiotherapy in gastric cancer cell SGC-7901 to investigate whether the Protosappanin A could increase radiosensitivity(SER)in gastric cancer SGC-7901 cells.This will be medication to create new areas of innovation in the future.MethodsThe cell proliferation of SGC-7901 cells was detected by MTT assay.The relationship between the effect of the Protosappanin A on cell proliferation and the time of action was determined.Caesalpinia Sappan L extract and Cisplatin were as controls.The fitted cell survival curve and clonal formation assays were used to determine the SER to analyze the sensitizative effect of Protosappanin A.ResultsProtosappanin A could inhibit the growth of SGC-7901 cells，and its inhibitory effect is relatively weak.Its cytotoxicity has a time-and concentration-dependent manner.Cellular morphological changes were observed accompanying with increased concentrations and time treatments of Protosappanin A.Clonal formation experiment showed that the Protosappanin A significantly increased the radiosensitivity of SGC-7901 cells when compared to the radioactive group.They showed a statistically difference.ConclusionThe inhibitory effect of the Protosappanin A on SGC-7901 cells in a concentration and time-dependent manner.Protosappanin A combined radiotherapy can improve the radiosensitization of cells，both of which may have synergistic anti-tumor effect.

Protosappanin A；Caesalpinia Sappan L extract；Gastric cancer；Radiotherapy；Radiosensitivity

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸部放療二病區(qū)(哈爾濱 150081)

劉國慧，女，(1989-)，碩士，住院醫(yī)師，從事胸腹部腫瘤放射治療的研究。

鄂明艷，E-mail：emingyansci@126.com

R285.6；R730.5

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.06.004

(收稿：2017-05-21)