顏文杰，李 湘，黃嘉韻

（廣東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院耳鼻喉科，廣東佛山528200）

EGFR在鼻咽癌臨床分期中的作用

顏文杰，李 湘，黃嘉韻

（廣東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院耳鼻喉科，廣東佛山528200）

目的 探討EGFR在鼻咽癌臨床分期中的作用。方法 將鼻咽未分化非角化癌60例及鼻咽良性病變（慢性鼻咽炎及腺樣體組織）30例的病理組織，利用免疫組化二步法檢測其中EGFR的表達(dá)情況，結(jié)果經(jīng)IPP6.0進(jìn)行圖像分析，并將檢測結(jié)果與臨床病理特征進(jìn)行綜合分析。結(jié)果 EGFR在鼻咽癌及慢性鼻咽炎病理組織中，都存在EGFR的表達(dá)，并在鼻咽未分化非角化癌組織中高表達(dá)，其MOD（EGFR）與鼻咽良性病變組織相比，存在顯著性差異（p=0.004＜0.01），并且MOD（EGFR）與鼻咽癌的臨床分期存在正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)0.786，鼻咽癌組織EGFR的表達(dá)與T分期正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)0.722，與N分期存在一定相關(guān)性，N2與N3之間MOD（EGFR）無顯著性差異（p＞0.05），剩余組間比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05），并且MOD（EGFR）隨著N分期的升高，有逐漸升高的趨勢，但N分期與MOD（EGFR）的相關(guān)系數(shù)僅為0.250；結(jié)論 在鼻咽癌及鼻咽良性病變病理組織中，都存在EGFR的表達(dá)，但在鼻咽癌組織中高表達(dá)，EGFR表達(dá)可能與鼻咽癌腫瘤細(xì)胞增殖活躍度密切相關(guān)；鼻咽病理組織中EGFR的免疫組化測定作為一種判斷鼻咽腫瘤細(xì)胞增殖情況的指標(biāo)，在臨床中值得推廣

鼻咽癌；表皮生長因子受體；免疫組織化學(xué)；顯微圖像分析

EGFR（Epidermal growth factor receptor，EGFR）屬I型跨膜酪氨酸激酶受體（Tyrosine kinase receptor，TKR），是原癌基因c-erbB1的表達(dá)產(chǎn)物，具備酪氨酸蛋白激酶(PTK)活性，在大多數(shù)正常細(xì)胞表面均有表達(dá)［1］。EGFR于上皮組織中過度表達(dá)，與腫瘤的增殖調(diào)節(jié)失控密切相關(guān)，是惡性腫瘤發(fā)病的重要機(jī)制，在許多上皮來源腫瘤，EGFR都存在高表達(dá)，其與腫瘤發(fā)病、病理分型、臨床分期、放療敏感性等高度相關(guān)，其作用機(jī)理可能與細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)失控、促進(jìn)腫瘤血管增生、阻滯細(xì)胞凋亡等有關(guān)［2］。

鼻咽癌主要發(fā)生在中國及東南亞各國，尤其以我國廣東省的珠江流域及西江流域一帶最為高發(fā)。當(dāng)前，臨床上用于鼻咽癌診斷初篩最常用的是EB二項檢查，包括有VCA-IgA（EB病毒殼抗原抗體IgA）、EA-IgA（EB病毒早期抗原抗體IgA）。對于診斷鼻咽癌，VCA-IgA具有較高的敏感性，但是特異性較差，而EA-IgA的診斷特異性則較高，但是敏感性較差。在鼻咽癌患者中，EB病毒抗體陽性率高達(dá)93%左右［3］。由此可見，EB二項的檢測是臨床篩查鼻咽癌的重要指標(biāo)。但是，目前的研究還不能證明EB病毒抗體的水平能反應(yīng)患者體內(nèi)腫瘤負(fù)荷的變化或作為鼻咽癌預(yù)后判斷的生物學(xué)指標(biāo)，在放化療后生存5年以上腫瘤治療達(dá)到CR無復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的病人中，有很多患者仍保持著較高的EB病毒抗體滴度［4］。

本研究通過測定鼻咽癌及鼻咽良性病變病理組織中EGFR的平均光密度MOD（mean of optical density）值，了解EGFR在鼻咽癌及鼻咽良性病變組織中的表達(dá)情況，并探索EGFR在鼻咽癌臨床分期中的作用及相關(guān)性，試圖找到一種相較EB兩項更能夠反映鼻咽癌腫瘤細(xì)胞增殖情況的指標(biāo)，具有重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源和臨床資料

收集2015年1月至2017年7月在我院住院行病理活檢確診的初診鼻咽癌患者60例，作為實驗組，同期隨機(jī)選取病理報告診斷為鼻咽良性病變（鼻咽慢性粘膜炎及腺樣體組織）30例，作為對照組。實驗組中患者年齡25歲～80歲，平均（51.12±12.87）歲，其中男性41例，女性19例，鼻咽癌病人均行鼻咽、頸部MRI，胸片、肝膽脾胰彩超、全身骨掃描檢查，明確TNM分期，T114例，T221例，T321例，T44例；N015例，N121例，N219例，N35例；M056例，M14例；按2003年UICC/AJCC修定的鼻咽癌國際分期標(biāo)準(zhǔn)確定臨床分期，臨床分期I期7例，Ⅱ期20例，Ⅲ期22例，Ⅳ期11例；對照組中患者年齡4歲～73歲，平均（36.83±21.91）歲，其中男性17例，女性13例。

1.2 儀器和試劑

鼠抗人EGFR單克隆抗體、免疫組化二步法廣譜染色試劑盒由金域檢驗公司提供。半自動石蠟切片機(jī)、電熱恒溫水槽、全自動染色封片機(jī)、微波爐、倒置顯微鏡等實驗儀器由金域病理科提供。

1.3 免疫組織化學(xué)方法

采用免疫組化（EliVisionTM二步法）進(jìn)行EGFR抗體染色，操作步驟按以下操作流程進(jìn)行。用己知陽性切片作陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

操作流程具體如下：1、切片（4 μm 連續(xù)切片）；2、烤片（60℃ 60 min）；3、切片脫蠟至水（二甲苯 15 min）；4、梯度酒精脫水 5、3%H2O2 室溫 15 min；6、PBS 沖洗 3×3 min；7、將切片放置在枸櫞酸中高壓抗原修復(fù)（噴氣后 1’30”）；8、PBS 沖洗；9、滴加 1 抗，室溫放置 60 min 孵育；10、PBS 沖洗 3×3 min；11、滴加試劑 1（紅）常溫 20 min；12、PBS 沖洗 3×3 min；13、滴加試劑 2（紫）常溫 20 min；14、PBS 沖洗 3×3 min；15、DAB 顯色；16、自來水沖洗；17、蘇木素復(fù)染、封片；18、脫水、透明、封片。

1.4 結(jié)果判定

利用Olympus顯微鏡先在（×100）鏡下拍照，了解EGFR在整張切片的表達(dá)大致情況，再在（×400）鏡下每張切片隨機(jī)選取5個視野（盡量減少無效的留白區(qū)域），使用IPP6.0專業(yè)圖像分析軟件，首先校正光密度；選取圖像中的AOI（area of interest），即EGFR蛋白表達(dá)區(qū)域（免疫組化染色呈黃色或棕黃色的區(qū)域），接下來再將AOI區(qū)域行灰度處理，計算其累計光密度值IOD（integrated optical density）的總和SUM（IOD），然后圈定并計算有效病理組織區(qū)域的面積area，得到選擇區(qū)域內(nèi)的光密度平均值SUM（IOD）/area，定義為M0D（Mean of optical density），結(jié)果取5個視野下測得的的M0D的算數(shù)平均值。

1.5 統(tǒng)計方法

統(tǒng)計軟件采用SPSS19.0，做數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用卡方檢驗，計量資料采用t檢驗，各臨床分期、TNM分期組間比較采用q檢驗（Newman-Keuls法）多重均數(shù)比較，并在比較前作方差齊性檢驗，MOD（EGFR）與各臨床要素的相關(guān)性用多元線性回歸分析，并計算相關(guān)系數(shù)。

2 實驗結(jié)果及結(jié)論

2.1 EGFR的表達(dá)形式

在鼻咽粘膜慢性炎癥組織中，EGFR主要表達(dá)在上皮細(xì)胞，尤其在基底細(xì)胞層的細(xì)胞膜上，胞漿內(nèi)也呈現(xiàn)彌散狀表達(dá)，EGFR在炎性淋巴細(xì)胞中是無表達(dá)的，見圖1。

圖1

在鼻咽癌細(xì)胞中，EGFR都存在不同程度的表達(dá)。EGFR主要表達(dá)在癌細(xì)胞膜周圍，表現(xiàn)出類似串珠狀的分布，胞漿內(nèi)也可呈現(xiàn)一定數(shù)量的顆粒狀陽性表達(dá)。見圖2。

圖2

2.2 MOD（EGFR）在鼻咽癌及鼻咽良性病變中的總體比較

從表1及圖3可以得出，兩組MOD（EGFR）經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且實驗組EGFR表達(dá)明顯高于對照組（p=0.004<0.01）。

表1 兩組MOD（EGFR）比較

圖3 MOD對照圖

2.3 EGFR與鼻咽癌臨床分期及TNM分期的相關(guān)性：

2.3.1 鼻咽癌臨床分期與MOD（EGFR）的相關(guān)性（見表2）

表2 不同臨床分期中MOD（EGFR）比較

圖4

不同臨床分期組間經(jīng)方差齊性檢驗，X2=7.043，p=0.0705>0.05，基于方差齊的不同分期鼻咽癌患者M(jìn)OD（EGFR）采用q檢驗（Newman-Keuls法）多重均數(shù)比較（見表3）：

表3 不同臨床分期中MOD(EGFR)的組間多重均數(shù)比較

由表3可見，Ⅰ期與Ⅱ期比較，MOD（EGFR）的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05），其他各組間兩兩比較，MOD（EGFR）的差異都存在顯著性（p<0.01），并與臨床分期正相關(guān)，隨分期的升高，MOD（EGFR）也呈現(xiàn)增大的趨勢（見表2及圖4）。并將臨床分期與MOD（EGFR）進(jìn)行相關(guān)回歸分析，MOD（EGFR）與臨床分期存在顯著正相關(guān)性（p=0.000<0.01），相關(guān)系數(shù)是0.786。

2.3.2 鼻咽癌TNM分期與MOD（EGFR）的相關(guān)性

表4 MOD（EGFR）在不同T、N分期中的比較

圖5

表4和圖5可以看出不同T、N分期患者的各組整體均數(shù)不相等（p＜0.01），經(jīng)方差分析，不同T分期組間經(jīng)方差齊性檢驗，X2=2.564 5，p=0.464＞0.05，方差齊，不同T分期鼻咽癌患者M(jìn)OD（EGFR）采用Newman-Keuls法多重均數(shù)比較結(jié)果如下：各組間MOD（EGFR）均存在顯著性差異（p＜0.01），隨著T分期的升高，MOD（EGFR）逐漸升高，T分期與MOD（EGFR）呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.722。不同N分期組間經(jīng)方差齊性檢驗，X2=0.340 8，p=0.952＞0.05，結(jié)果顯示方差齊，不同的N分期間MOD（EGFR）使用Newman-Keuls法多重均數(shù)比較，結(jié)果顯示：N2與N3之間MOD（EGFR）差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p＞0.05），其余各組間均存在差異（p＜0.05），隨著N分期的升高，MOD（EGFR）有逐漸升高的趨勢，但N分期與MOD（EGFR）的相關(guān)系數(shù)僅為0.250。由于M1只有4例，而M0有56例，由于兩組間的樣本量差別太大，所以組間比較無意義。

3 討論

EGFR的高表達(dá)可致上皮細(xì)胞癌變，促進(jìn)新生血管形成、腫瘤細(xì)胞生長增殖、侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［5］。本研究中，在鼻咽病理組織的鱗狀上皮細(xì)胞中，EGFR在基底層細(xì)胞的表達(dá)相比棘細(xì)胞層，其陽性表達(dá)更強(qiáng)，這可能間接反應(yīng)EGFR與調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的分化過程有一定關(guān)聯(lián)。Herbst［6］等研究表明在大部分實體腫瘤中，EGFR均有高表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，EGFR在鼻咽良性病變及腫瘤組織細(xì)胞的胞膜和胞漿中均有表達(dá)，其主要表達(dá)在細(xì)胞膜上，EGFR在鼻咽未分化型非角化癌的表達(dá)明顯高于鼻咽良性病變組織中的表達(dá)，結(jié)果存在顯著性差異（p=0.004＜0.01）。但因為鼻咽良性病變的選擇上有一部分是兒童鼻咽腺樣體組織，兩組患者的年齡比較存在差異（p＞0.05），可能不能完全排除年齡因素的影響。

賈代杰［7］研究顯示，在鼻咽癌患者組織中，EGFR的陽性表達(dá)率為73.8%，而在慢性鼻炎患者組織中的陽性表達(dá)率分別為32.3%，兩組比較均有差異（p＜0.05）。鼻咽癌組織中EGFR蛋白的表達(dá)與TNM分期、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)聯(lián)（p＜0.05）。本研究結(jié)果與此相似，EGFR的表達(dá)與臨床分期存在顯著正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.786。并且與T、N分期有一定的相關(guān)性，其中EGFR與T分期呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.722，與N分期的相關(guān)系數(shù)僅為0.250，N2與N3之間MOD(EGFR)差異無顯著性（p＞0.05），剩余組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05），并與N分期存在一定正相關(guān)，隨著其N分期升高，MOD（EGFR）也逐漸升高。該結(jié)果證明EGFR可能和鼻咽癌發(fā)病及進(jìn)展相關(guān)，EGFR可能與腫瘤細(xì)胞增殖活躍相關(guān)。本研究通過對初診鼻咽癌及鼻咽良性病變病理組織中MOD（EGFR）的測定，探索EGFR與鼻咽癌臨床分期及TNM分期的相關(guān)性及其在鼻咽癌預(yù)后判斷上的輔助作用。

王樹森［8］利用免疫組織化學(xué)方法檢測55例鼻咽癌組織，發(fā)現(xiàn)EGFR陽性表達(dá)率為70.9%，EGFR陽性患者5年生存率下降。可能與EGFR信號途徑?jīng)Q定腫瘤細(xì)胞放射敏感性有關(guān)。Akimoto［9］等對9種不同腫瘤細(xì)胞的大鼠進(jìn)行試驗，EGFR的表達(dá)強(qiáng)度與放射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平呈負(fù)相關(guān)，曲媛等［10］研究發(fā)現(xiàn)血漿和組織中EGFR和VEGF表達(dá)水平可能與鼻咽癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，與放化療敏感性呈負(fù)相關(guān)。放療前對鼻咽癌患者病理組織中EGFR進(jìn)行檢測，可預(yù)測腫瘤對放療的敏感度［11］。本研究尚未涉及EGFR與放射敏感性的關(guān)系，對入組的病人進(jìn)一步長期隨訪，并了解患者的生活質(zhì)量，從而探索放化療后的腫瘤轉(zhuǎn)歸預(yù)后，進(jìn)一步探索EGFR與鼻咽癌生存時間和生活質(zhì)量的相關(guān)性，是未來研究和努力的方向。

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Effect study on EGFR in clinicalstaging of nasopharyngeal carcinoma

YAN Wen-jie,LI Xiang,HUANG Jia-yun
（Guangdong Province Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Foshan 528000,China）

Objective To investigate the role of EGFR in the clinicalgrading of nasopharyngeal carcinoma(NPC).Methods Examining the expression of EGFR by Two-step Method in immunohistochemistry on the pathological tissue specimens from 60 NPC patients and 30 patients with benign nasopharyngeal diseases,the resultwas analyzed by the IPP6.0.The clinical pathological features of these specimens were also taken into account.Results The expression of EGFR was found in the pathological tissue specimens of both NPC patients and chronic nasopharyngitis patients but higher in the specimens of NPC patients.The MOD (EGFR)of NPC specimens have significant difference(p=0.004＜0.01)with chronic nasopharyngitis specimens.Also,MOD(EGFR)has positive correlation(correlation coefficient=0.786)with clinical staging ofnasopharyngeal carcinoma.The expression of EGFR in nasopharyngeal carcinoma tissuewas positively correlated with T scale(correlation coefficient=0.722).Itwas also correlated with Nscale,there were no significant difference(p＞0.05)between MOD (EGFR)of N2 and N3,but significant difference(p＜0.05)was found between other groups,the MOD(EGFR)gradually increased with the upgrade of N scale,but the correlation coefficient between Nscale and MOD (EGFR)was only 0.250;Conclusion The expression of EGFR was found in the pathological tissue specimens of both NPC patients and chronic nasopharyngitis patients but higher in the specimens of NPC patients.The expression of EGFRmay be closely related to the proliferation vitality of NPC tumor cells.As an indicator of nasopharyngeal tumor cell proliferation,immunohistochemical exanmination of EGFR worth popularizing in clinicalpractice.

nasopharyngeal carcinoma;epidermal growth factor receptor;immunohistochemistry;microscopic imageanalysis

R766.3

A

1008-0171（2017）06-0062-06

2017-10-09

廣東省佛山市衛(wèi)生局醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金（2015218）

顏文杰（1984-），男，江西上饒人，廣東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院主治醫(yī)師。

鄧軍文 dengjunwen69@126.com】