楊 芳 吳澤幼 包 思 梁 敬

（南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣東 廣州 510515）

缺血/再灌注損傷所致心肌梗死是威脅我國居民生命健康的重大疾病之一，其發(fā)生與活性氧增多導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷等相關(guān)［1］。目前，有效降低缺血心肌細胞氧化應(yīng)激損傷是防治心肌梗死的有效手段之一。NF-E2相關(guān)因子2（Nrf2）通路可降低活性氧對心肌細胞毒性，緩解心肌細胞應(yīng)激性氧化損傷，保護心肌細胞［2］。松果菊苷（ECH）具有抗氧化、誘導(dǎo)細胞分化和抗腫瘤等多種藥用活性［3］。研究發(fā)現(xiàn)，松果菊苷對血管性癡呆大鼠氧化應(yīng)激損傷具有保護作用［4］。李歡等發(fā)現(xiàn)，松果菊苷可通過降低細胞內(nèi)活性氧水平、減輕炎癥反應(yīng)，具有保護血管內(nèi)皮細胞損傷的作用［5］。目前，關(guān)于松果菊苷對心肌細胞應(yīng)激性氧化損傷的保護作用及機制的相關(guān)研究比較少。因此，本研究采用H2O2構(gòu)建心肌細胞氧化應(yīng)激性損傷模型，觀察松果菊苷對H2O2所致心肌細胞毒性的影響及對Nrf2通路的影響，以揭示松果菊苷保護H2O2所致心肌細胞損傷的作用機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 大鼠心肌細胞H9c2（2-1），購自中國科學(xué)院細胞庫。

1.2 試藥與儀器 松果菊苷（純度＞98%），購自上海寶曼生物公司，批號201605；Nrf2抑制劑鴉膽苦醇（純度≥95%），購自美國Sigma公司，批號20160807；30%H2O2（批號 20150108）、DMEM 培養(yǎng)基（批號 8114031）、FBS（批號1227694），購自美國Sigma公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒、LDH檢測試劑盒、SOD檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）、細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒，購自碧云天公司；ELC發(fā)光試劑盒、96孔板，購自Bio-Rad公司；BCA試劑盒，購自美國Thermo公司；抗體，購自美國CST公司。Elx800酶標儀，購自美國Biotek公司；熒光顯微鏡，購自美國Olympus公司；CO2培養(yǎng)箱，購自美國Thermo公司。

1.3 實驗方法 細胞培養(yǎng)及處理：采用DMEM培養(yǎng)基（含15%FBS）培養(yǎng)H9c2細胞，每2日傳代1次，培養(yǎng)條件：5%CO2，37℃。無菌操作，收集對數(shù)生長期細胞用于實驗。1）H2O2半數(shù)致死濃度確定：在DMEM培養(yǎng)基中分別加入終濃度為 0、50、100、200、400、600 μmol/L H2O2，孵育4 h，采用MTT法對H9c2細胞存活情況進行鑒定，繪制生長率抑制曲線，計算出H2O2半數(shù)致死濃度，作為實驗濃度。2）實驗分組及處理：將H9c2細胞分為空白對照組、H2O2模型組、松果菊苷低劑量組（5 mg/L）、中劑量組（10 mg/L）、高劑量組（20mg/L）。在松果菊苷處理組細胞培養(yǎng)基中分別加入相應(yīng)濃度松果菊苷，空白對照組和H2O2模型組加入0.9%0.9%氯化鈉注射液，預(yù)孵育6 h，收集各組細胞，檢測各項指標。1.4 觀察指標 1）流式細胞儀檢測心肌細胞H9c2凋亡情況：收集經(jīng)過相應(yīng)處理的各孔H9c2細胞，加入胰蛋白酶進行消化，按照AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡試劑盒（碧云天）說明書對細胞進行處理，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，采用BD FACSDiva軟件統(tǒng)計凋亡細胞所占百分比。每組處理設(shè)置4個重復(fù)，實驗重復(fù)3次。2）流式細胞儀檢測吸進細胞H9c2線粒體膜電位（MMP）水平：收集經(jīng)過相應(yīng)處理的各孔H9c2細胞，加入胰蛋白酶進行消化，按照線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）說明書處理細胞，采用流式細胞儀進行檢測。采用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體膜電位（MMP）水平變化情況。3）試劑盒檢測培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶（LDH）、心肌激酶（CK）、丙二醛（MDA）含量：按照試劑盒操作說明，對各組細胞培養(yǎng)液及H9c2細胞內(nèi)LDH、CK和MDA的含量進行測定。LDH釋放率/%=培養(yǎng)液中LDH含量/（培養(yǎng)液中LDH含量+細胞內(nèi)LDH含量）×100%，CK和MDA釋放率計算方法同LDH。每組設(shè)置4個重復(fù)，實驗重復(fù)3次。4）Western blot檢測細胞核、質(zhì)中Nrf2蛋白表達水平：按照細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒說明書，分別提取各組H9c2細胞質(zhì)及細胞核總蛋白，采用BCA試劑盒測定總蛋白含量。以GAPDH為內(nèi)參，采用western blot檢測細胞質(zhì)中Nrf2蛋白水平。以Lamin B為內(nèi)參，采用Western blot檢測細胞核中Nrf2蛋白水平。采用Tanon全自動圖像分析系統(tǒng)進行拍照并對細胞核、細胞質(zhì)Nrf2蛋白相對表達水平進行半定量分析。5）采用流式細胞術(shù)檢測Nrf2抑制劑預(yù)處理后心肌細胞凋亡情況和MMP水平：在20mg/L松果菊苷處理H9c2細胞前30min，給予細胞10μmol/L Nrf2抑制劑鴉膽苦醇預(yù)處理。按照前文中方法檢測心肌細胞H9c2凋亡情況和MMP水平。1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗進行差異性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 H2O2對心肌細胞的毒性 見圖1。結(jié)果顯示，100、200、300、400、500 μmol/L H2O2均能抑制 H9c2 細胞生長，呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)。300μmol/LH2O2作用H9c2細胞6h時，對細胞生長抑制率約為50%。因此，本研究選擇此濃度處理H9c2細胞以構(gòu)建H2O2損傷模型。

H2O2μmol/L圖1 不同濃度H2O2對H9c2細胞增殖的影響

2.2 各組心肌細胞凋亡情況比較 見圖2和表1。與空白對照組比較，H2O2模型組細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與 H2O2模型組比較，松果菊苷處理組，細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）。隨著松果菊苷濃度的增加，細胞凋亡率逐漸降低（P＜0.05）。

圖2AnnexinV-FITC/PI聯(lián)合流式細胞儀檢測各組H9c2細胞凋亡情況

表1 各組心肌細胞凋亡率（%，±s）

表1 各組心肌細胞凋亡率（%，±s）

與對照組比較，*P＜0.05；與 H2O2模型組比較，◇P＜0.05；與 5mg/L比較，☆P＜0.05；與 10mg/L 比較，△P＜0.05。 下同。

組 別 n對照組 4 H 2 O 2模型組 4 5 m g/L松果菊苷組 4凋亡率7.7±0.4 6 6 5.7±5.6 6*3 6.8±3.4 1*◇1 0 m g/L 松果菊苷組 4 1 7.6±2.0 2*◇☆2 0 m g/L 松果菊苷組 4 1 1.9±0.5 8*◇☆△

2.3 各組心肌細胞線粒體損傷程度比較 見圖3和表2。空白對照組比較，H2O2模型組細胞線粒體膜電位顯著降低（P＜0.05）；與H2O2模型組比較，松果菊苷處理組細胞MMP均顯著升高（P＜0.05），隨著松果菊苷濃度的增加，細胞MMP逐漸升高（P＜0.05）。

圖3 JC-1聯(lián)合流式細胞術(shù)檢測各組H9c2細胞MMP變化情況

表2 各組心肌細胞線粒體損傷程度比較（%，±s）

表2 各組心肌細胞線粒體損傷程度比較（%，±s）

組 別 n對照組 4 H 2 O 2模型組 4 5 m g/L松果菊苷組 4 J C-1 r e d/g r e e n 9 9.7±0.4 6 1 0.7±1.6 6*1 9.8±1.4 1*◇1 0 m g/L 松果菊苷組 4 3 7.6±2.0 5*◇☆2 0 m g/L 松果菊苷組 4 5 1.9±0.6 8*◇☆△

2.4 各組心肌細胞LDH、CK及MDA釋放率比較見表3。與空白對照組比較，H2O2模型組的LDH、CK、MDA釋放率顯著增高（P＜0.05）。與H2O2模型組比較，松果菊苷處理組LDH、CK、MDA釋放率均顯著降低（P＜0.05）， 隨著松果菊苷濃度的增加，LDH、CK、MDA釋放率逐漸降低（P＜0.05）。

表3 各組心肌細胞LDH、CK及MDA釋放率比較（%，±s）

表3 各組心肌細胞LDH、CK及MDA釋放率比較（%，±s）

組別 n M D A對照組 4 9.7±0.8 9 H 2 O 2模型組 4 2 7.7±2.9 6*5 m g/L 松果菊苷組 4 2 0.9±0.8 1*◇L D H C K 1 8.7±1.0 6 1 0.3±0.9 6 6 9.7±2.9 6* 4 2.7±1.9 6*4 8.9±1.8 1*◇ 3 4.9±1.9 4*◇1 0 m g/L 松果菊苷組 4 1 5.6±0.7 5*◇☆3 4.6±1.7 5*◇☆ 2 4.6±2.3 5*◇☆2 0 m g/L 松果菊苷組 4 2 1.3±1.5 8*◇☆△ 1 7.3±2.5 8*◇☆△ 1 1.3±0.8 8*◇☆△

2.5 各組心肌細胞質(zhì)、細胞核中Nrf2蛋白水平比較見圖4和表4。與空白對照組比較，H2O2模型組細胞核中Nrf2蛋白水平明顯增加（P＜0.05）；與H2O2模型組比較，松果菊苷處理組細胞核Nrf2蛋白水平進一步增加（P＜0.05），隨著松果菊苷濃度的增加，細胞核Nrf2蛋白水平逐漸增加（P＜0.05）。H2O2模型組細胞質(zhì)Nrf2蛋白水平與空白對照組比較（P＞0.05）；與H2O2模型組比較，松果菊苷處理組細胞質(zhì)Nrf2蛋白水平顯著降低（P＜0.05），隨著松果菊苷濃度的增加，細胞質(zhì)Nrf2蛋白水平逐漸降低（P＜0.05）。

圖4 松果菊苷處理對Nrf2蛋白水平的影響

表4 果菊苷處理后各組心肌細胞細胞質(zhì)、細胞核中Nrf2 蛋白水平（%，±s）

表4 果菊苷處理后各組心肌細胞細胞質(zhì)、細胞核中Nrf2 蛋白水平（%，±s）

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2.6 Nrf2抑制劑能拮抗松果菊苷對H2O2所致心肌細胞損傷的保護作用 見圖5和表5。為明確Nrf2通路在H2O2所致心肌細胞損傷中的作用，本研究在20mg/L松果菊苷處理前30 min，給予H9c2心肌細胞10μmol/L Nrf2抑制劑鴉膽苦醇處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與松果菊苷處理組比較，鴉膽苦醇處理后細胞凋亡率明顯升高（33.97±4.52%vs 18.08±2.83%，P＜0.05）， 線粒體損傷加重，MMP 顯著降低（52.0±3.79%vs 18.33±5.46%，P＜0.05）。

圖5 Nrf2抑制劑松對松果菊苷對H2O2所致心肌細胞損傷的保護作用

表5 Nrf2抑制劑對心肌胞凋亡率及MMP的影響（%，±s）

表5 Nrf2抑制劑對心肌胞凋亡率及MMP的影響（%，±s）

與對照組比較，*P＜0.05；與20 mg/L松果菊苷組比較，◇P＜0.05。

組 別 n對照組 4 20mg/L松果菊苷組 4細胞凋亡率 MMP 9.7±1.56 98.3±1.26 19.7±1.75* 51.7±1.96*松果菊苷+Nrf抑制劑組 4 35.9±2.31*◇ 18.9±2.34*◇

3 討 論

心肌缺血/再灌注損傷是一個復(fù)雜病理過程，其發(fā)生機制與活性氧增多、鈣超載及能量代謝障礙等相關(guān)［6-7］?；钚匝踉龆嗨录毎蛲鍪菍?dǎo)致心肌損傷的重要因素［8］。因此，尋找能有效減輕心肌細胞氧化損傷藥物，是臨床防治I/R損傷亟待解決的問題。

松果菊苷是松果菊、肉蓯蓉等植物主要活性成分之一，具有抗氧化等多種活性。研究發(fā)現(xiàn)，H2O2會導(dǎo)致細胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷［7］。丁慧等發(fā)現(xiàn)，松果菊苷能加快清除氧自由基，降低大鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平［11］。H9c2心肌細胞是一株成熟細胞系，已廣泛用于心肌缺血、氧化應(yīng)激反應(yīng)及有效藥物篩選等研究［9］。本研究采用100～500μmol/L H2O2處理H9c2細胞，篩選出H2O2最適作用濃度 （300μmol/L），并構(gòu)建氧化損傷模型。Yan等發(fā)現(xiàn)，線粒體膜電位的異常改變可導(dǎo)致心肌細胞凋亡［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2處理心肌細胞，細胞凋亡率明顯增加，線粒體膜電位顯著下降；松果菊苷處理后，細胞凋亡率明顯降低，線粒體膜電位顯著升高。提示松果菊苷能保護H2O2所致線粒體損傷，抑制H2O2所致心肌細胞凋亡。

受到外界刺激時，細胞膜通透性增加，大量細胞內(nèi)關(guān)鍵酶CK、LDH及一些代謝產(chǎn)物MDA進入培養(yǎng)基［12-13］。研究發(fā)現(xiàn)［14］，紅車軸總黃酮能減輕細胞 MDA損傷、減少LDH漏出。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2模型組LDH、CK、MDA釋放率顯著增高。松果菊苷處理后，LDH、CK、MDA釋放率明顯降低，隨著松果菊苷濃度增加，LDH、CK、MDA釋放率逐漸降低，提示松果菊苷對心肌細胞膜具有保護作用，可減輕H2O2所致心肌細胞損傷。

研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2通路激活能保護活性氧所致心肌細胞損傷［15-16］。正常生理狀態(tài)下，細胞質(zhì)中Nrf2與Keap1結(jié)合，呈無活性狀態(tài)，受到活性氧等刺激時，Nrf2與Keap1脫離，轉(zhuǎn)移至細胞核而激活，與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，激活相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄［17］。Tsai等發(fā)現(xiàn)，二烯丙基三硫化物能激活Nrf2進而激活PI3K/akt通路，保護高糖誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡［18］。Strom發(fā)現(xiàn)，Nrf2能與線粒體相互作用，保護線粒體免受H2O2所致氧化損傷［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，松果菊苷處理后，Nrf2水平在細胞質(zhì)顯著降低，在細胞核顯著升高，與賀海波等［20］的發(fā)現(xiàn)一致，提示松果菊苷能促進Nrf2向細胞核轉(zhuǎn)移而激活。在20mg/L松果菊苷處理前30 min，給予H9c2細胞10μmol/L鴉膽苦醇處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鴉膽苦醇處理后細胞凋亡率明顯升高，線粒體MMP明顯降低，表明抑制Nrf2活性能促進心肌細胞凋亡，誘導(dǎo)線粒體損傷。

綜上所述，松果菊苷能保護H2O2所致心肌細胞凋亡及損傷，推測其機制是促進Nrf2向細胞核移位而活化，為治療心肌缺血/再灌注損傷提供新思路。Nrf2向細胞核轉(zhuǎn)移激活后，調(diào)節(jié)哪些基因轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生哪些因子發(fā)揮保護作用尚不清楚，將在后續(xù)研究中加以研究。

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