楊桂菊 張東霞

（1.山東省濟(jì)寧市中醫(yī)院，山東 濟(jì)寧 272000；2.山東省濟(jì)寧市第二人民醫(yī)院，山東 濟(jì)寧272000）

急性壞死性胰腺炎是由多種病因?qū)е碌囊认俳M織水腫、出血以及胰腺組織的自身消化［1-2］，在發(fā)病早期會(huì)引發(fā)全身性的炎癥反應(yīng)及多個(gè)器官功能障礙，肺損傷是臨床常見(jiàn)的并發(fā)癥之一［3］。研究表明，由急性壞死性胰腺炎引發(fā)的肺損傷約占肺損傷總數(shù)的15%～55%，而且肺損傷也是造成早期急性壞死性胰腺炎患者死亡的主要原因［4］，因此，急性壞死性胰腺炎的早期預(yù)防和治療已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)工作者研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。目前臨床上治療急性壞死性胰腺炎的主要手段有抗生素治療和手術(shù)治療，前者主要集中在對(duì)抗炎癥方面，不能有效地根除病因，且長(zhǎng)期服用抗生素會(huì)增加機(jī)體的耐藥性，手術(shù)治療的費(fèi)用較高，且不能一次性有效切除壞死胰腺組織，術(shù)后還需要進(jìn)行多次的藥物腹腔灌洗，因此探尋高效、安全、低毒的藥物是臨床治療急性壞死性胰腺炎的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究以急性壞死性胰腺炎大鼠模型為研究對(duì)象，觀察黃芪多糖對(duì)大鼠急性壞死性胰腺炎肺損傷的影響，并探討其潛在的分子機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康Wistar雄性大鼠65只，清潔級(jí)，6～8 周齡，體質(zhì)量（120±20）g，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，許可證號(hào)：SYXK（京）2015-0043。實(shí)驗(yàn)前將大鼠移置實(shí)驗(yàn)室，自然光照室溫22～23℃，濕度40%～65%，噪音≤50 dB，自由飲水，進(jìn)食。

1.2 試藥與儀器 黃芪多糖 （生產(chǎn)批號(hào)：120102，純度＞98%）購(gòu)自賽諾制藥有限公司；RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；TaqDNA聚合酶購(gòu)自NEB公司；羊抗鼠p38MAPK、HSP27、pp38MAPK、p-HSP27多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；MPO試劑盒購(gòu)自上海賽默科技生物發(fā)展有限公司；3K15超低溫離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Sigma公司；SW-CJ-2D2G2F2FD雙人凈化工作臺(tái)購(gòu)自蘇州蘇凈；引物序列，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 造模及分組 從65只大鼠中隨機(jī)選取10只，開(kāi)腹后翻動(dòng)十二指腸，并觸碰胰腺數(shù)次但不造成胰腺損傷，縫合腹腔，作為假手術(shù)組。其余大鼠按照文獻(xiàn)資料［5］禁食12 h，術(shù)前稱重，按1 mL/100 g腹腔注射4%水合氯醛進(jìn)行麻醉，用75%酒精消毒，仰臥位固定于平板上，在無(wú)菌條件下于腹部正中切口，暴露十二指腸，找到膽胰管十二指腸開(kāi)口處，用無(wú)損傷血管夾夾閉肝總管，用3號(hào)針頭經(jīng)十二指腸漿肌層行膽胰管逆行穿刺手術(shù)，用無(wú)損傷血管夾夾閉肝總管遠(yuǎn)端，用微量注射器向膽胰管內(nèi)注射5%牛黃膽酸鈉 （此操作要緩慢均勻），注射結(jié)束后觀察10 min，確認(rèn)大鼠脾、胃及十二指腸間的胰腺組織出現(xiàn)出血壞死后拔除針頭、去除血管夾并縫合腹腔。待動(dòng)物蘇醒后回籠飼養(yǎng)。將造模成功的大鼠隨機(jī)分成4組，每組10只，包括模型組、黃芪多糖低劑量組、黃芪多糖中劑量組和黃芪多糖高劑量組，黃芪多糖組按低、中、高劑量分別給予200 mg/kg、400mg/kg、600mg/kg黃芪多糖灌胃治療，持續(xù)治療2周；假手術(shù)組及模型組給予等量容積0.9%氯化鈉注射液灌胃。

1.4 各組大鼠肺組織含水量測(cè)定 治療結(jié)束后，將大鼠進(jìn)行脫頸椎處死，將大鼠置于75%的酒精中消毒2～3 min，將大鼠腹部和胸部剪毛，于無(wú)菌條件下打開(kāi)大鼠胸腔取出肺組織，用吸水紙吸取其表面血跡和水分，稱其濕重后，置于90℃烘箱，直至質(zhì)量不再變化，稱其干質(zhì)量，計(jì)算肺系數(shù)。肺系數(shù)＝（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/干質(zhì)量。

1.5 各組大鼠肺組織中MPO的活性測(cè)定 取100mg分離的肺組織，稱重，加入1mL 0.5%溴化十六烷基三甲胺溶液，經(jīng)超聲破碎后，置于超低溫離心機(jī)離心，12000 r/min離心10 min，收集離心上清液，采用髓過(guò)氧化物酶（MPO）試劑盒測(cè)定5組大鼠肺組織中MPO的活性。

1.6 HE染色檢測(cè)肺組織的病理學(xué)變化 將肺部組織放入4%多聚甲醛液中固定24 h，然后放入25%甲酸脫鈣液脫鈣處理，用預(yù)冷的PBS溶液洗滌2～3次，分別用70%、80%、90%、95%、100%的乙醇進(jìn)行梯度脫水，二甲苯透明處理，組織浸蠟包埋，用切片機(jī)切出4μm厚切片，然后脫蠟，用 100%、95%、90%、80%、70%的乙醇和蒸餾水逐級(jí)復(fù)水，用蘇木精染色5min，用二甲苯透明處理、中樹(shù)膠封片。在顯微鏡下觀察5組大鼠肺組織的病理學(xué)變化。各組大鼠肺損傷評(píng)分情況［6］根據(jù)肺出血、組織水腫、小氣道損傷、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)進(jìn)行肺損傷評(píng)分，0級(jí)為無(wú)以上幾種病理學(xué)變化；1級(jí)為病理變化輕且局限；3級(jí)為病理變化中等且局部顯著；4級(jí)為廣泛性病理變化且非常顯著。

1.7 Westernblot檢測(cè) p38MAPK、p-p38MAPK、HSP27、p-HSP27蛋白表達(dá)情況 取肺部組織加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，以GAPDH為內(nèi)參，取20μL蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜50min，滴加羊抗鼠 p38MAPK、p-p38MAPK、HSP27、p-HSP27多克隆抗體，置于4℃下過(guò)夜，滴加二抗37℃放置1 h。加入ECL發(fā)光劑進(jìn)行顯影，利用自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。采用Gel-Pro analyzer4軟件對(duì)SDS-PAGE電泳圖目的條帶進(jìn)行掃描，分析p38MAPK、p-p38MAPK、HSP27、p-HSP27的表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組肺損傷評(píng)分檢測(cè)肺部變化情況比較 見(jiàn)表1。模型組肺組織中出血、組織水腫、小氣道損傷、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05）；黃芪多糖組肺組織中出血、組織水腫、小氣道損傷、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分顯著低于模型組（P＜0.05）；且隨著黃芪多糖劑量增加，肺組織中出血、組織水腫、小氣道損傷、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分顯著降低（P＜0.05），呈劑量依賴性。

表1 各組大鼠肺組織中出血、組織水腫、小氣道損傷、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分比較（分，±s）

表1 各組大鼠肺組織中出血、組織水腫、小氣道損傷、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分比較（分，±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與黃芪多糖低劑量組比較，▲P＜0.05；與黃芪多糖中劑量組比較，$P＜0.05。下同。

組別 n假手術(shù)組 10模型組 10黃芪多糖低劑量組 10出血 組織水腫 小氣道損傷 炎性細(xì)胞浸潤(rùn)0.42±0.04 0.54±0.05 0.63±0.04 0.36±0.03 2.92±0.26* 3.24±0.32* 3.56±0.36* 2.74±0.22*2.46±0.24△ 2.75±0.24△ 2.84±0.25△ 2.24±0.20△黃芪多糖中劑量組 10 1.92±0.18△▲ 2.02±0.21△▲ 2.11±0.23△▲ 1.72±0.16△▲黃芪多糖高劑量組 10 1.12±0.15△▲$1.36±0.16△▲$1.47±0.17△▲$0.96±0.13△▲$

2.2 各組大鼠肺組織含水量測(cè)定比較 見(jiàn)表2。模型組肺系數(shù)顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05）；黃芪多糖組肺系數(shù)顯著低于模型組（P＜0.05）；且隨著黃芪多糖劑量增加，肺系數(shù)顯著降低（P＜0.05），呈劑量依賴性。

表2 各組大鼠肺組織肺系數(shù)測(cè)定比較（±s）

表2 各組大鼠肺組織肺系數(shù)測(cè)定比較（±s）

組 別 n假手術(shù)組 10模型組 10黃芪多糖低劑量組 10肺系數(shù) MPO活性3.24±0.28 1.09±0.12 7.24±0.64* 2.32±0.26*6.16±0.56△ 1.04±0.22△黃芪多糖中劑量組 10 5.08±0.52△▲ 1.68±0.19△▲黃芪多糖高劑量組 10 4.01±0.51△▲$ 1.34±0.15△▲$

2.3 各組大鼠肺組織中MPO活性測(cè)定比較 見(jiàn)表2。模型組肺組織中MPO的活性顯著高于假手術(shù)組 （P＜0.05）；黃芪多糖組肺組織中MPO的活性顯著低于模型組（P＜0.05）；且隨著黃芪多糖劑量增加，肺組織中MPO的活性顯著降低（P＜0.05），呈劑量依賴性。

2.4 各組HE染色檢測(cè)肺組織病理學(xué)變化比較 見(jiàn)圖1。HE染色結(jié)果顯示，模型組大鼠肺泡塌陷、肺泡間隙變大，肺小葉結(jié)構(gòu)遭到破壞，邊界模糊不清；假手術(shù)組大鼠肺組織未見(jiàn)明顯異常，與模型組相比，黃芪多糖組肺泡間隙變小，且隨黃芪多糖劑量增加，肺泡間隙逐漸縮小。

圖1 各組肺組織病理學(xué)變化（HE染色，400倍）

2.5 各組 Western blot檢測(cè) p38MAPK、p-p38MAPK、HSP27、p-HSP27蛋白表達(dá)情況比較 見(jiàn)表3。各組大鼠肺組織中p38MAPK、HSP27的表達(dá)水平相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；模型組肺組織中 pp38MAPK、p-HSP27的表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05）；黃芪多糖組肺組織中p-p38MAPK、p-HSP27的表達(dá)水平顯著低于模型組（P＜0.05）；且隨黃芪多糖劑量增加，肺組織中p-p38MAPK、p-HSP27的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），呈劑量依賴性。

表3 各組大鼠Western blot檢測(cè)p38MAPK、p-p38MAPK、HSP27、p-HSP27 表達(dá)情況比較（±s）

表3 各組大鼠Western blot檢測(cè)p38MAPK、p-p38MAPK、HSP27、p-HSP27 表達(dá)情況比較（±s）

組 別 n假手術(shù)組 10模型組 10黃芪多糖低劑量組 10 p38MAPK p-p38MAPK HSP27 p-HSP27 0.83±0.08 0.56±0.05 0.66±0.06 0.52±0.05 0.82±0.07* 1.22±0.16* 0.67±0.07* 1.08±0.14*0.84±0.08△ 1.04±0.12△ 0.68±0.07△ 0.96±0.10△黃芪多糖中劑量組 10 0.85±0.09△▲ 0.86±0.09△▲ 0.68±0.06△▲ 0.82±0.08△▲黃芪多糖高劑量組 10 0.83±0.09△▲$0.72±0.07△▲$0.66±0.07△▲$0.68±0.07△▲$

3 討 論

急性壞死性胰腺炎 是常見(jiàn)的急腹癥，具有發(fā)病快、病死率高、并發(fā)癥多、治療難度大等特點(diǎn)［7］。引發(fā)急性壞死性胰腺炎的主要原因包括兩方面：血液循環(huán)障礙和體內(nèi)有害物質(zhì)的積累，但具體的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。急性壞死性胰腺炎會(huì)引發(fā)多種并發(fā)癥，其中肺損傷是臨床常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為肺水腫、胸腔積液和呼吸困難，這也是誘發(fā)急性壞死性胰腺炎患者死亡的主要原因［8］。急性壞死性胰腺炎的臨床癥狀主要表現(xiàn)為持續(xù)性發(fā)熱、急劇腹痛、糞樣嘔吐、嚴(yán)重的機(jī)體脫水，甚至休克［9］，給患者帶來(lái)極大痛苦，因此，急性壞死性胰腺炎的治療是醫(yī)學(xué)工作者研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。

西醫(yī)治療急性壞死性胰腺炎存在一定的局限性，而中醫(yī)中藥由于其安全、低毒的特點(diǎn)受到醫(yī)學(xué)工作者的廣泛關(guān)注。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，急性壞死性胰腺炎屬于“腹痛”“胃脘痛”“脅痛”“結(jié)胸”“厥脫”等范疇［10］，因此，中醫(yī)治療急性壞死性胰腺炎以活血化瘀、理氣通絡(luò)為主［11］。 據(jù)《本草綱目》記載，黃芪能夠通絡(luò)補(bǔ)氣、補(bǔ)肺健脾［12］。 黃芪多糖（APS）是蒙古黃芪根的提取成分，具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等多種藥理作用。研究表明，APS還具有增強(qiáng)機(jī)體免疫、促進(jìn)荷瘤小鼠T、B淋巴細(xì)胞的增殖等作用［13］。王秉均研究表明，APS對(duì)大鼠重癥急性胰腺炎有保護(hù)作用［14］，然而APS對(duì)急性壞死性胰腺炎大鼠肺損傷的影響尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究表明，模型組肺損傷、肺系數(shù)、MPO的活性顯著高于假手術(shù)組；黃芪多糖組肺損傷、肺系數(shù)、MPO的活性顯著低于模型組；且隨黃芪多糖劑量增加，肺損傷、肺系數(shù)、MPO的活性顯著降低，呈劑量依賴性。肺系數(shù)越大說(shuō)明肺組織水腫嚴(yán)重，MPO的活性與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，隨MPO的活性升高，中性粒細(xì)胞增多，炎癥反應(yīng)加重。以上結(jié)果均提示，黃芪多糖能夠減輕急性壞死性胰腺炎大鼠肺損傷。

p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）能夠參與細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，與細(xì)胞和生物體的多種生命活動(dòng)密切相關(guān)。p38MAPK介導(dǎo)信號(hào)通路在機(jī)體的炎癥反應(yīng)中具有重要作用［15］。 Choi研究表明，p38MAPK 的活化可以促進(jìn)IL-1、IL-6、TNF-α等炎性因子的釋放，進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體免疫反應(yīng)的發(fā)生［16］；還有研究表明，p38MAPK在大鼠重癥急性胰腺炎大鼠肺損傷的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用［17］；江濤研究表明，抑制p38MAPK信號(hào)通路可以減輕重癥急性胰腺炎胰腺［18］。在p38MAPK/HSP27通路中，p38MAPK磷酸化后能夠調(diào)節(jié)下游的絲裂原活化蛋白激活熱休克蛋白 27 （HSP27）［19］，HSP27 作為一種分子伴侶能夠參與各種信號(hào)通路，并與通路中的關(guān)鍵分子相互作用，使其維持正常的功能［20］。近年來(lái)不少學(xué)者研究表明HSP27在急性胰腺炎及其并發(fā)癥中發(fā)揮著重要作用。劉樂(lè)偉研究表明，HSP27下調(diào)表達(dá)可以減輕重癥胰腺炎大鼠肺損傷［21］。本研究表明，假手術(shù)組未見(jiàn)明顯異常；模型組p-p38MAPK、p-HSP27的表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組；黃芪多糖組p-p38MAPK、p-HSP27的表達(dá)水平顯著低于模型組；且隨黃芪多糖劑量增加，p-p38MAPK、p-HSP27的表達(dá)水平顯著降低，呈劑量依賴性，提示，黃芪多糖能夠抑制急性壞死性胰腺炎大鼠肺組織中p38MAPK/HSP27通路。

綜上所述，黃芪多糖能減輕急性壞死性胰腺炎大鼠肺損傷，推測(cè)這一作用是通過(guò)抑制p38MAPKHSP27通路實(shí)現(xiàn)的，為臨床治療急性壞死性胰腺炎肺損傷提供一定參考依據(jù)。

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