田 心 王淵博

（1.陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710003；2.沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110015；3.第四軍醫(yī)大學(xué)，陜西 西安 710032）

腺苷酸活化的蛋白激酶（AMPK）是調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝的重要分子［1］，當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，胞內(nèi)的AMP不斷堆積，由此激活A(yù)MPK。AMPK通過(guò)增加在胞內(nèi)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)以及糖酵解，維持ATP濃度，而使細(xì)胞生存。丹紅注射液在臨床治療缺血性心臟病多年，療效良好。本實(shí)驗(yàn)旨在闡明丹紅注射液保護(hù)心肌的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD雄性大鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。36只，體質(zhì)量200～250 g，SPF級(jí)飼養(yǎng)條件，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（軍）字第2007-007號(hào)。

1.2 試藥與儀器

丹紅注射液購(gòu)自陜西步長(zhǎng)制藥有限公司 （國(guó)藥準(zhǔn)字：Z20026866，規(guī)格：10mL/支，批號(hào)：15041024）。兔抗p-AMPKα、AMPKα抗體購(gòu)自美國(guó)abcam公司；肌鈣蛋白 T（TnT）、乳酸脫氫酶（LDH）的 ELISA 試劑盒購(gòu)自AMEKO公司；酶標(biāo)儀為美國(guó)Molecular Devises公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品；透射電鏡為日本JEOL公司產(chǎn)品；電泳系統(tǒng)及凝膠成像系統(tǒng)均為Bio Rad公司產(chǎn)品。

1.3 造模方法

用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠（1.5mL/kg），氣管插管，微型動(dòng)物呼吸機(jī)給予正壓機(jī)械通氣，常規(guī)肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖記錄心電活動(dòng)，分離左側(cè)頸靜脈，經(jīng)左側(cè)頸靜脈插管，建立給藥途徑；于大鼠胸骨左緣第4～5肋間開(kāi)胸，暴露心臟，撕開(kāi)心包膜，在左心耳下緣處穿線（6/0絲線），以備結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支（LAD），用直徑約0.2 cm細(xì)塑料管穿過(guò)結(jié)扎線，以心電圖ST段明顯抬高、缺血數(shù)分鐘后出現(xiàn)明顯的心律失常作為心肌缺血標(biāo)志。缺血30min，再灌注2 h。

1.4 分組與給藥［2］

將36只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、對(duì)照加丹紅組、缺血/再灌注組、缺血/再灌注加丹紅組。每組9只。為保證實(shí)驗(yàn)質(zhì)量，借鑒于文獻(xiàn)［2］研究發(fā)現(xiàn)的藥效時(shí)間點(diǎn)，最大藥效時(shí)間點(diǎn)為10 min，最小藥效時(shí)間點(diǎn)為60 min，按8 mL/kg于再灌注即刻到結(jié)束進(jìn)行全程頸靜脈給藥；對(duì)照組及缺血/再灌注組給予等體積的無(wú)菌生理鹽水。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.5.1 ELISA檢測(cè)血清中TnT、LDH水平 12只大鼠心尖部穿刺取血，室溫放置1 h后，3000 r/min離心15 min，取上清液于-80℃冰箱凍存。按試劑盒要求操作，用酶標(biāo)儀測(cè)定各組樣品的吸光度（450 nm）值（OD值），用標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，并算出方程，將各組OD值代入進(jìn)行計(jì)算出待測(cè)樣品的濃度值（至少重復(fù)3次）。

1.5.2 蘇木素堿性復(fù)紅苦味酸染色（HBFP）［3］之前12只大鼠取血完畢后，分別摘取心臟組織，于4%多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋切片。將組織切片常規(guī)脫蠟至水，明礬蘇木素浸染15 s，常規(guī)自來(lái)水沖洗5 min，后用0.1%堿性復(fù)紅液浸染3 mins，用蒸餾水輕輕沖洗10 s，然后用純丙酮浸泡8 mins，之后用0.1%苦味酸丙酮液分化20 s，至切片上無(wú)紅色洗脫為止；最后以二甲苯透明后用中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5.3 透射電鏡觀察心肌線粒體形態(tài) 另12只大鼠實(shí)驗(yàn)完畢后，心肌缺血再灌注后，將心臟切出，放置于呈有PBS溶液的容器內(nèi)，擠壓出殘留于心腔內(nèi)的血液。沿心臟長(zhǎng)軸的左心組織結(jié)扎血管以下區(qū)域，剪裁下約2mm×3mm長(zhǎng)條形的2塊心肌組織，放置2.5%的戊二醛中固定2 h，PBS漂洗3次，每次10min，1%鋨酸固定2 h，又以PBS漂洗，之后梯度乙醇脫水處理、浸透，再經(jīng)過(guò)環(huán)氧樹(shù)脂的包埋處理。光鏡定位后超薄切片機(jī)切割其為厚度20 nm心肌組織切片，經(jīng)鈾鉛等染色后，置于透射電鏡下，觀察心肌內(nèi)線粒排列分布、線粒體大小改變、線粒體膜及線粒體嵴的結(jié)構(gòu)變化情況。

1.5.4 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測(cè)心肌組織中p-AMPKα/AMPKα的表達(dá) 余12只大鼠實(shí)驗(yàn)完畢后摘取心臟，切取結(jié)扎線周?chē)呐K組織，用組織裂解液加蛋白磷酸酶抑制劑提取各組心肌組織蛋白，并進(jìn)行蛋白定量，用SDS-PAGE進(jìn)行電泳，并將其轉(zhuǎn)膜到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，100 g/L的脫脂牛奶室溫封閉1 h后，滴加1∶800的抗p-AMPKα、AMPKα一抗孵育過(guò)夜，PBST 洗膜（5 min，5 次），再用 1∶5000 特異性二抗室溫孵育1 h后洗膜（5min，5次），進(jìn)入發(fā)光儀器后滴加顯影液曝光后觀察結(jié)果，并利用Quantity One軟件對(duì)目的條帶分析獲取數(shù)據(jù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間兩兩比較采用組間t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌缺血再灌注的血清TnT、LDH水平比較

見(jiàn)表1。心肌缺血再灌注時(shí)，TnT、LDH明顯升高（P＜0.01），使用丹紅注射液后，TnT、LDH明顯降低（P＜0.01），丹紅注射液可明顯減輕心肌缺血再灌注的TnT、LDH 水平。

表1 各組大鼠心肌缺血再灌注的血清TnT、LDH水平比較（±s）

表1 各組大鼠心肌缺血再灌注的血清TnT、LDH水平比較（±s）

與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與缺血再灌注組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同。

組 別 n TnT（μg/L） LDH（ng/mL）對(duì)照組 3 13.44±2.48 27.96±2.45對(duì)照加丹紅組 3 12.82±2.88 28.03±1.93缺血再灌注組 3 37.83±5.94** 71.53±8.32**缺血再灌注加丹紅組 3 18.22±4.03△△ 33.49±3.40△△

2.2 各組大鼠心肌缺血再灌注心肌組織壞死情況比較

見(jiàn)圖1。對(duì)心肌組織的特殊染色分析可見(jiàn)：對(duì)照組和對(duì)照加丹紅組的心肌組織，用HBFP法染色可見(jiàn)心肌細(xì)胞呈黃色或黃棕色，細(xì)胞核呈藍(lán)褐色；缺血再灌注組的心肌組織中可見(jiàn)大片深紅色改變，而缺血再灌注加丹紅組心肌組織中可見(jiàn)深紅色改變明顯減輕，區(qū)域局限縮小。由此可見(jiàn)，丹紅注射液可以減少心肌缺血再灌注的壞死。

2.3 各組大鼠缺血再灌注心肌細(xì)胞線粒體損傷情況比較

見(jiàn)圖2。大鼠缺血區(qū)域心肌組織的透射電鏡圖片顯示：對(duì)照組和對(duì)照加丹紅組的心肌細(xì)胞線粒體排列整齊，呈融合狀；缺血再灌注組的心肌細(xì)胞線粒體呈腫脹改變，部分線粒體分裂明顯，呈空泡狀改變；缺血再灌注加丹紅組的心肌細(xì)胞線粒體其病態(tài)改變減輕，線粒體排列較整齊。由此可見(jiàn)，丹紅注射液可減輕缺血再灌注心肌細(xì)胞線粒體損傷。

圖1 大鼠的心肌組織切片（HBFP染色，100倍）

圖2 大鼠心肌細(xì)胞線粒體的透射電鏡成像（10000倍）

2.4 各組大鼠缺血/再灌注心肌AMPK的磷酸化水平比較 如圖3，表2。結(jié)果示，正常大鼠心肌中，加用丹紅注射液 的p-AMPKα/AMPKα 水平升高 （P＜0.05）；缺血再灌注時(shí)，AMPK激活，p-AMPKα/AMPKα水平升高（P＜0.01）；缺血再灌注時(shí)，給予丹紅注射液治療，AMPK進(jìn)一步激活，較單純?nèi)毖俟嘧-AMPKα/AMPKα水平升高（P＜0.05）；說(shuō)明丹紅注射液可以上調(diào)缺血再灌注心肌AMPK磷酸化水平。

圖3 丹紅注射液對(duì)心肌p-AMPKα/AMPKα表達(dá)的Western Blot圖

表2 各組心肌細(xì)胞p-AMPKα/AMPKα表達(dá)比較（±s）

表2 各組心肌細(xì)胞p-AMPKα/AMPKα表達(dá)比較（±s）

組 別 n 灰度比（p-AMPKα/AMPKα）對(duì)照組 3 0.51±0.11對(duì)照加丹紅組 3 0.92±0.20*缺血再灌注組 3 1.31±0.18**缺血再灌注加丹紅組 3 2.32±0.57**△

3 討 論

基于缺血性心臟病的病理生理中，缺血缺氧為其最基本的病變，由此而引發(fā)心肌氧供與需求的失衡，AMPK經(jīng)典的激活機(jī)制定義為細(xì)胞能量狀態(tài)受AMP/ATP和ADP/ATP的比值影響［4］。在再灌注中，也就是當(dāng)氧供再補(bǔ)充時(shí)，AMPK誘導(dǎo)的糖酵解有害地影響自由脂肪酸代謝，從而在再灌注過(guò)程中阻礙了心臟豐富的ATP產(chǎn)生能力［5］。然而，AMPK激活的純粹作用是有益的，Kim等［6］證實(shí)在LAD閉塞小鼠中，用藥物激活A(yù)MPK時(shí)，梗死面積減小，心臟機(jī)能得到更好的保護(hù)，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)凋亡和壞死減輕。線粒體為細(xì)胞能量代謝供氧、ATP，其結(jié)構(gòu)和功能改變對(duì)心血管生理和病理起著關(guān)鍵作用［7］。采用有效藥物干預(yù)保護(hù)心肌細(xì)胞線粒體是近年來(lái)心血管領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

丹紅注射液是臨床上使用最多的活血化瘀類(lèi)中藥注射劑之一［8-9］。丹紅注射液目前已明確的有效物質(zhì)為丹參素、原兒茶醛、羥基紅花黃色素A、迷迭香酸、丹酚酸B等7種物質(zhì)［2］。其主要成分與血漿蛋白結(jié)合率均＞60%，其組分間的相互競(jìng)爭(zhēng)影響較?。?0］。早期研究發(fā)現(xiàn)［11-12］，丹紅注射液主要成分改善氧化應(yīng)激所致的線粒體損傷，防止線粒體質(zhì)子ATP酶水解，顯示良好的保護(hù)作用；同時(shí)丹紅注射液有減輕缺血再灌注心肌血管內(nèi)皮炎癥，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、改善血管內(nèi)皮功能紊亂的作用［13］。 已有報(bào)道［14］丹紅注射液能夠減輕缺血再灌心肌細(xì)胞凋亡，且與濃度有一定的依賴(lài)關(guān)系。丹紅注射液其有效應(yīng)用在神經(jīng)系統(tǒng)疾病亦有報(bào)道，丹紅注射液具有保護(hù)腦出血大鼠神經(jīng)系統(tǒng)功能和減輕腦水腫的作用［15］，且丹紅注射液對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷的治療時(shí)間窗應(yīng)在4 h內(nèi)，機(jī)制與抗氧化有關(guān)［16］。但丹紅注射液對(duì)AMPK的激活作用卻尚未報(bào)道，因此本研究應(yīng)用較特殊的HBFP病理染色和心肌酶學(xué)指標(biāo)，以及基礎(chǔ)的免疫印跡法和電鏡技術(shù)闡述了丹紅注射液減輕缺血再灌注心肌及線粒體損傷是通過(guò)激活A(yù)MPK來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，丹紅注射液能夠激活缺血再灌注心肌AMPK信號(hào)通路，發(fā)揮能量調(diào)控作用，保護(hù)心肌損傷及線粒體損傷，本基礎(chǔ)研究局限于丹紅注射液激活A(yù)MPK信號(hào)通路，我們下一步將闡述其對(duì)AMPK信號(hào)下游分子的影響及具體保護(hù)機(jī)制。

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