劉祥含 唐天向 孫 超 隋麗波 張 慧 張傳利 李麗萍 林良斌

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院1，昆明 650201) (云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院2, 普洱 665000) (云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)科專業(yè)實驗教學(xué)中心3，昆明 650201)

幾個關(guān)鍵油脂合成酶活性對油菜含油量影響的研究

劉祥含1唐天向1孫 超1隋麗波1張 慧1張傳利2李麗萍3林良斌1

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院1，昆明 650201) (云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院2, 普洱 665000) (云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)科專業(yè)實驗教學(xué)中心3，昆明 650201)

以不同含油量的甘藍型油菜品種或品系為材料，采用ELISA 法檢測了油脂累積過程中乙酰輔酶A羧化酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、磷脂酸磷酸酯酶、二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶等4種關(guān)鍵酶在不同發(fā)育時期的種子和角果皮中的酶活性變化，并分析了酶活性與種子含油量的相關(guān)性。研究結(jié)果表明，不同含油量的油菜品種在種子和角果皮中酶活性的變化趨勢基本一致，在開花后第17天至第24天迅速增加，第38天時達到峰值，然后逐漸下降，但角果成熟時間較短的酶活性下降很快，如花油8號的角果成熟期只有40.2 d，比其他3個品種早熟1周。相關(guān)性分析表明種子中DGAT、PPase、G6PDH的酶活性與菜籽含油量呈極顯著正相關(guān)，ACCase酶活性與菜籽含油量呈顯著正相關(guān)，而角果皮中ACCase、G6PDH、PPase、DGAT的酶活性與菜籽含油量呈正相關(guān)，但沒達到顯著水平，其中4種酶的酶活性與菜籽含油量的相關(guān)性大小依次為DGAT、PPase、G6PDH、ACCase。因此，在進行高含油量油菜品種選育時應(yīng)著重考慮油脂累積中DGAT、PPase的基因表達水平和酶活性水平。

油菜 含油量 ACCase G6PDH PPase DGAT

油菜(Brassicanapus)是我國乃至世界上的主要油料作物之一，是植物油脂的第三大來源，我國的油菜種植面積和總產(chǎn)量均位居世界第一[1]，菜籽的含油量直接影響著油菜的經(jīng)濟效益，是當(dāng)前油菜育種中重要的技術(shù)難點，因此提高菜籽含油量是當(dāng)前油菜育種的主要目標之一[2]。油菜種子油脂累積涉及十多個酶促反應(yīng)，酶活性的高低直接影響著菜籽的含油量。近年來國內(nèi)外研究者對酶活性與含油量的關(guān)系開展了一些研究工作，例如，Turnham 等[3]研究表明油菜種子中脂肪酸合成速率受控于ACCase活性的高低，認為ACCase是油菜種子中油脂累積的一個關(guān)鍵限速酶；Ohlrogge等[4-5]和Topfer等[6]的研究認為對油菜種子油脂累積關(guān)鍵受ACCase、PPase和DGAT等酶活性高低的影響；陳玉萍等[7]研究結(jié)果表明高含油量油菜品系的G6PDH活性高于低含油量品系，且油分合成旺盛的時期G6PDH活性最大；唐湘如等[8]研究表明，油菜種子的PPase酶活性與種子含油量有密切關(guān)系，在育種中可作為選擇高含油量品種的生化指標之一。然而前人研究一般以2個不同含油量的油菜品種為材料，只對油脂累積過程中1～3個酶進行研究，并且沒有進行不同發(fā)育時期的酶活性變化規(guī)律研究和生物統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性分析。

本研究以不同含油量4個油菜品種或系為材料，研究了油菜種子發(fā)育過程中乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl CoAcarboxylase ，ACCase)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase，G6PDH)、磷脂酸磷酸酯酶(Phospha-tidic acid phophyhydrolase，PPase)、二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(Diacylglycero-lacyl transferase，DGAT)4種酶在油菜種子發(fā)育過程中種子和角果皮中的酶活性變化趨勢及酶活性高低與含油量的關(guān)系，并進行了種子酶活性高低與菜籽含油量的相關(guān)性分析，同時研究了4個油菜品種的生育習(xí)性，希望弄清相關(guān)酶活性及生育習(xí)性對菜籽含油量的影響及其程度大小，從而揭示油菜高含油量的生理生化機制，希望在酶促反應(yīng)相關(guān)酶活性及變化趨勢上為育成高含油量油菜提供了酶活力數(shù)據(jù)的支持，從而為油菜高含油量育種和栽培提供酶活性及生育習(xí)性方面的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為4個不同含油量的甘藍型油菜品種或品系，即是：ZY511，其種子含油量為 50.21%；LCD07-4，其種子含油量為47.19%；花油8號，其種子含油量為42.57%；湘油774，其種子含油量為37.32%，均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜研究室提供。

ELISA試劑盒：上海優(yōu)選生物科技有限公司，型號分別為CK-E0066P、CK-E0089P、CK-E0173P和CK-E0256P。

1.2 試驗方法

1.2.1 油菜種植與取樣

4個油菜材料于2015年10月10日種植于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)后山農(nóng)場，并進行常規(guī)油菜栽培管理。在油菜開花時對植株長勢一致的主花序基部1/3處當(dāng)天開放的花蕾進行掛牌，并標記日期。在開花后第17天進行取樣，每隔7 d取樣1次，共5次，每個品種取樣3株。將取下的樣品立即放入冰盒中，在冰浴中迅速將種子和角果分離，分別稱重0.2 g鮮組織用液氮迅速冷凍后保存于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，每種組織材料保存4份，用于粗酶液的提取。

1.2.2 油菜生育習(xí)性調(diào)查

每個材料隨機取5株分別記錄每株花期(以第1朵花開到最后1朵花落)、角果成熟期(以主花序中部角果從花落到角果成熟)、生育期(從播種到成熟收獲)。

1.2.3 粗酶液的分離制備

從-80 ℃冰箱中取出材料放入研缽中加液氮研磨成粉末，并迅速盡量全部轉(zhuǎn)移入10 mL離心管內(nèi)，加入2 mL預(yù)冷的提取Buffer(100 mmol/L Tris-HCl pH=7.3、300 mmol/L 甘油、5 mmol/L DTT、2 mol/L EDTA、0.5 mmol/L PMSF、0.01%體積Triton X-100)，然后在渦旋振動器上振動2 min充分混勻后4 ℃靜置1 h，再加10 μL 0.5 mmol/L PMSF并混勻，4 ℃靜置1 h。4 ℃、3 500 r/min離心30 min，將上清液盡量轉(zhuǎn)移到另一離心管內(nèi)，并定容至體積2 mL，即為粗酶液，用于酶活性測定。

1.2.4 ELISA法測定酶活性

在酶標板上設(shè)置標準品孔、樣本孔和空白孔，用于標準曲線制作、樣本酶活性檢測和酶標儀零校對。標準品孔各加不同酶活力單位的標準品50 μL；樣本孔加待測樣本10 μL(以a表示)，再加樣本稀釋液40 μL；空白孔加去離子10 μL，再加樣本稀釋液40 μL。吸附結(jié)合30 min鐘后用洗滌液洗板5次。然后每孔加入辣根過氧化物酶標記抗體100 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃水浴保溫60 min，棄去液體，在吸水紙上拍干，然后每孔加洗滌液300 μL，靜置1 min，棄去洗滌液，在吸水紙上拍干，如此洗板 5 次。每孔再加入底物 A、底物B各50 μL，37 ℃ 水浴避光保溫15 min。然后每孔再加入終止液50 μL，15 min 內(nèi)，在450 nm波長處測定各孔的OD值。然后以標準孔的OD450值和相應(yīng)標準品的酶活力單位制作標準曲線。然后以樣品孔的OD450值根據(jù)標準曲線獲得粗酶液樣品的酶活力單位(以b表示)。每克鮮組織的酶活力按公式計算(1 U是指在標準條件下1 min能轉(zhuǎn)化1 μmol底物的所需酶量)，各樣品的酶活性測定重復(fù)3次。

U/g=b/a×2 000÷0.2

1.2.5 數(shù)據(jù)處理方法

采用Excel 2010作圖；采用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同含油量油菜品種的生育習(xí)性

隨機選取5株，對各油菜品種的生育習(xí)性進行調(diào)查，結(jié)果表明(表1)，試驗材料的生育期不同，花油8號為早熟品種，生育期只有176.6 d，而其他3個材料生育期相差不大，較花油8號晚熟10 d以上。生育期長的材料，其角果成熟期和花期也相對較長，但角果成熟期變化較大，花油8號比其他3個材料短1周以上，而花期變化較小，花油8號比其他3個材料短2 d。

表1 不同油菜品種的生育習(xí)性

2.2 種子和角果皮中ACCase的活性變化及其對菜籽含油量的影響

對不同含油量的油菜品種/品系進行了種子和角果皮的ACCase活性檢測，結(jié)果(圖1)表明，所有研究對象的種子ACCase活性均高于角果皮的，特別是在中期角果中高2U左右。在開花后17～38 d各試驗材料種子和角果皮的ACCase活性呈上升變化，其中從開花后17～24 d ACCase活性上升很快，但種子的比角果皮的上升要緩慢些，而在24 d后種子的比角果皮的上升要快些。第38天后除花油8號的迅速下降，湘油774的稍有上升，其他2個材料的不再呈上升趨勢，這可能與花油8號的角果成熟期短有關(guān)，因為38 d時它的角果開始變黃成熟，而其他品種在45 d后才開始變黃成熟。在不同發(fā)育時期的種子中含油量高的材料的ACCase活性均高于含油量低的，只是幅度不一樣，但角果皮的ACCase活性就不呈現(xiàn)這樣一個關(guān)系，如在中期角果中LCD07-4角果皮的ACCase活性接近甚至略高于ZY511的。這可能是由于角果皮主要是在進行光合作用和物質(zhì)積累，為油脂合成和累積提供物質(zhì)和能量，因此，角果皮中油脂合成酶的活性可能與菜籽含油量高低關(guān)系不大。

圖1 種子和角果皮中ACCase活性動態(tài)變化

2.3 種子和角果皮中G6PDH活性變化及其對菜籽含油量的影響

對不同含油量的油菜品種/品系進行了種子和角果皮的G6PDH活性檢測，結(jié)果(圖2)表明，所有材料的種子G6PDH活性均高于角果皮的，不同時期的種子和角果皮的酶活性變化趨勢如同ACCase，但從開花后17～24 d 酶活性上升非常緩慢，從24～31 d酶活性迅速上升，31～38 d G6PDH活性上升速度變緩，從38～45 d花油8號迅速下降，而其他3個材料的種子中酶活性或保持不變或略有下降，其原因如上所述。在第31天后含油量高的材料的種子和角果皮中的G6PDH活性均高于含油量低的，但31 d前并不呈現(xiàn)這樣的關(guān)系，花油8號的酶活性還高于LCD07-4，說明這個酶在31 d后對油脂累積影響比較大。

圖2 種子和角果皮中G6PDH活性動態(tài)變化

2.4 種子和角果皮中PPase活性變化及其對菜籽含油量的影響

對不同含油量的油菜品種/品系進行了種子和角果皮的PPase活性檢測，結(jié)果(圖3)表明，所有試驗材料的種子PPase活性均高于角果皮的，不同時期的種子和角果皮的酶活性變化趨勢如同前2種酶的活性變化。除LCD07-4外，其他3個材料在第38天前種子中的PPase活性均呈持續(xù)上升，而LCD07-4在24～31 d PPase活性上升非常緩慢，以致早期角果酶活性高的LCD07-4在中期角果中與花油8號的酶活性處于相同的水平，但第38天后花油8號的PPase活性迅速下降，這可能是花油8號的含油量低于LCD07-4的原因。在角果皮中第31天前的PPase活性均呈較迅速上升，第31天后除了湘油774的酶活性呈持續(xù)上升外，花油8號開始下降，并在38 d后迅速下降，其他2個材料酶活性上升緩慢或略有下降。在不同發(fā)育時期的種子和角果皮中含油量高的材料PPase活性一般都高于含油量低的，但LCD07-4與花油8號不呈現(xiàn)這種關(guān)系，可能與花油8號油脂累積時間短、第38天后其PPase活性迅速下降有關(guān)。

圖3 種子和角果皮中PPase活性動態(tài)變化

2.5 種子和角果皮中DGAT活性變化及其對菜籽含油量的影響

對不同含油量的油菜品種/品系進行了種子和角果皮的DGAT活性檢測，結(jié)果(圖4)表明，所有研究對象的種子DGAT活性均高于角果皮的，在38 d前種子中DGAT活性除湘油774呈緩慢上升外，其他3個材料呈迅速上升，38 d后除花油8號的迅速下降外，其他3個材料的呈非常緩慢上升或保持不變。在角果皮中DGAT活性各試驗材料38 d前均呈緩慢上升，38 d后除花油8號的迅速下降外，其他3個材料保持不變或稍有下降。在不同發(fā)育時期的種子中含油量高的材料DGAT活性均高于含油量低的，但角果皮就不呈現(xiàn)這種關(guān)系，如含油量低的花油8號還高于含油量高的LCD07-4，這說明種子中DGAT活性對菜籽含油量的影響更大。

圖4 種子和角果皮中DGAT活性動態(tài)變化

2.6 油脂累積的關(guān)鍵酶分析

分別對種子和角果皮中ACCase、G6PDH、PPase、DGAT酶活性與菜籽含油量進行相關(guān)性分析，結(jié)果(表2)表明，在種子中4種酶的活性與菜籽含油量呈顯著正相關(guān)，而角果皮中4種酶的活性與菜籽含油量呈正相關(guān)，但沒達到顯著水平，說明種子中酶活性對菜籽含油量的影響顯著大于角果皮的，而且種子中、DGAT的酶活性與菜籽含油量呈極顯著正相關(guān)，其相關(guān)性大小依次為DGAT>PPase>G6PDH>PPase，說明油脂累積過程中后階段酶的活性對菜籽含油量影響更大。因此，DGAT 、PPase是油脂累積極為關(guān)鍵的酶，其酶活性高低可作為高含量育種的選擇指標。

表2 種子和角果皮中酶活性與菜籽含油量的相關(guān)性

注：**表示 0.01 水平上顯著，*表示 0.05 水平上顯著。

3 討論與結(jié)論

含油量是當(dāng)前油菜育種的一個主要育種目標，許多研究者已從遺傳、生理生化和分子生物學(xué)方面研究了油菜含油量的生物學(xué)問題。本研究通過ELISA 法檢測了油菜種子發(fā)育過程中ACCase、G6PDH、PPase、DGAT酶活性變化，發(fā)現(xiàn)不管是含油量高的油菜，還是含油量低的油菜，在種子和角果皮中4種關(guān)鍵油脂合成酶的酶活性變化基本一致，在中期角果中達到最高值，即38DAF左右的角果。這與唐湘如等[8]、徐一蘭[9]和戚維聰[10]的研究結(jié)果一致，但代柳婷[11]的研究結(jié)果表明高含油量品種在40DAF低含油量品種在45DAF時PPase酶活性達到最高。本研究還發(fā)現(xiàn)油脂合成酶的酶活性高低對油菜含油量的影響非常大，酶活性高的品種或品系其含油量也高，酶活性低的品種或品系其含油量也低，特別是后期酶活性酶活性和角果成熟期的長短對油菜含油量的影響更大。這與前期研究者的研究結(jié)果基本一致。此外，在油脂累積過程中不同酶的酶活性對油菜含油量的影響是不一樣的，越是后期的酶影響就越大，種子中DGAT、PPase、G6PDH的酶活性與油菜含油量的相關(guān)性最大，達到極顯著水平，是油脂合成最為關(guān)鍵的酶，但角果皮中酶活性對油菜含油量有影響，沒有達到顯著水平。

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Influence on Seed Oil Content by Activities of Several Key Enzymes in Oil Synthesis of the Brassica napus

Liu Xianghan1Tang Tianxiang1Sun Chao1Sui Libo1Zhang Hui1Zhang Chuanli2Li Liping3Lin Liangbin1
(College of Agronomy and Biotechnology, Yunnan Agriculture University1, Kunming 650201) (College of Tropical Crops, Yunnan Agriculture University2, Puer 665000) (Experimental Teaching Center for Agricultural Profession Course, Yunnan Agriculture University3, Kunming 650201)

Withbrassicanapusvarieties or strains with different oil contents as experimental materials, the activity of four key enzymes in the process of oil accumulation, namely, acetyl-coa carboxylase (accase), glucose-6-Phosphate dehydrogenase (G6PDH), phospha-tidic acid phophyhydrolase (ppase), and diacylglycero-lacyl transferase(DGAT), were detected by ELISA methods in seed and pod peel at different developmental stages, and the correlation between enzyme activity and seed oil content was analyzed. The results indicated that the variation trend of enzyme activities in seeds and pod peel of rapeseed cultivars with different oil contents was basically the same. The enzyme activity was increased rapidly from the 17th day after flowering (DAF) to the 24th DAF, and reached the peak at the 38th DAF, then it was decreased gradually. However, the enzyme activity was decreased rapidly in Huayou 8 with shorter pod ripening time of 40.2 days, earlier than the other three varieties by a week. The correlation analysis showed that the activities of DGAT, ppase and G6PDH in seeds were extremely significant positively correlated with the seed oil content, the activities of accase were positively correlated with the seed oil content, While the activity of accase, G6PDH, ppase and DGAT in pod peel was positively correlated with the oil content of rapeseed, which did not reach the significant level. The correlation levels of the four kinds of enzymes with oil content in order were as follows: DGAT, ppase, G6PDH and accase. Therefore, the gene expression level and enzyme activity level of DGAT and Ppase genes in oil accumulation should be considered during the breeding of high oil content rapeseed varieties.

brassicanapus, oil content, accase, G6PDH, ppase, DGAT

S565.4

A

1003-0174(2017)12-0100-05

973計劃(2015CB150206)

2016-12-19

劉祥含，男，1991年出生，碩士，油菜生理生化

林良斌，男，1963年出生，教授，油菜分子生物學(xué)與育種