趙仲麟，李瑞歌，秦志揚，王 成，王 永,袁 超, 蘭青闊

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院, 河南 鄭州 450002； 2. 天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，天津 300381)

食品中綠豆成分PCR特異性檢測方法的建立

趙仲麟1，李瑞歌1，秦志揚1，王 成2，王 永2,袁 超1, 蘭青闊2

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院, 河南 鄭州 450002； 2. 天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，天津 300381)

針對綠豆物種特異性序列，設(shè)計了定性PCR引物，建立了綠豆源性成分檢測方法,并對0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μmol·L-1的引物濃度,52、54、56、58、60、62 ℃的退火溫度等反應(yīng)條件進行優(yōu)化，對該方法的靈敏度、特異性和檢出限進行了測試。結(jié)果表明,在引物濃度0.4 μmol·L-1、退火溫度58 ℃條件下的擴增效果最優(yōu)，綠豆的檢出限可達到0.5 %。該檢測方法具有高度的特異性，操作方便、簡單、快捷，可為食品安全的檢測提供依據(jù)。

食品; 綠豆成分；凝膠電泳；PCR；特異性檢測

目前，食品摻假問題是中國食品質(zhì)量管理面臨的重大挑戰(zhàn)之一[1]。假冒偽劣食品嚴(yán)重威脅人們的身體健康。人們在擔(dān)憂污染物對健康造成威脅的同時，食品摻假問題同樣引起人們的重視。以綠豆食品為例，一些企業(yè)為獲取高額利潤，常利用豌豆、大豆等其他原材料充當(dāng)綠豆食品出售，違反了消費者的合法權(quán)益[2]。中國政府也已加大對食品行業(yè)的監(jiān)管力度，同時制定更嚴(yán)苛的檢測標(biāo)準(zhǔn)，以期重拾消費者對政府和企業(yè)的信心。食品成分檢測的方法主要有：(1)依靠形態(tài)學(xué)鑒別手段的傳統(tǒng)感官或物理方法鑒別，如電子舌和電子鼻技術(shù)的應(yīng)用[3-4]；(2)基于儀器的檢測方法，如核磁共振波譜技術(shù)[5]、近紅外光譜技術(shù)[6]、液質(zhì)聯(lián)用[7]等方法；(3)蛋白質(zhì)大分子檢測方法，如利用雙抗體夾心ELISA法檢測食品中花生過敏原蛋白成分[8]；(4)DNA分子檢測方法，常用有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[9]、指紋圖譜技術(shù)[10]及基因芯片技術(shù)[11]。PCR方法具有特異性強，靈敏度高等特點，已經(jīng)普遍用于農(nóng)產(chǎn)品、食品的檢測分析中。目前，國內(nèi)還沒有針對綠豆制品的檢測分析標(biāo)準(zhǔn)。本研究采用的特異性PCR檢測手段，對食品中的綠豆成分進行檢測，以期為綠豆成分檢測的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 引物設(shè)計及篩選

收集、分析和驗證綠豆mgQ062FRFLP序列，獲得綠豆物種特異性序列。根據(jù)該特異性序列，設(shè)計定性PCR引物；在通用的PCR擴增程序和反應(yīng)體系條件下，比較不同引物擴增條帶的特異性、亮度等，選擇表現(xiàn)相對好的引物對作為候選引物對。

1.2 PCR反應(yīng)退火溫度和引物濃度優(yōu)化

本試驗設(shè)置引物濃度優(yōu)化范圍為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μmol·L-1，退火溫度優(yōu)化范圍 52、54、56、58、60、62 ℃，根據(jù)擴增條帶的亮度、引物二聚體等表現(xiàn)，確定合適的引物濃度和擴增退火溫度。DNA模板為50 mg·L-1(10%綠豆，基質(zhì)為小麥粉)，本試驗使用Taq DNA聚合酶、PCR緩沖液、dNTPs、MgCl2購自Promega公司的，引物由金唯智公司合成。

1.3 綠豆檢測方法特異性和檢出限測試

選用不同豆類作物及常見的農(nóng)作物共28種進行特異性測試，驗收標(biāo)準(zhǔn)是僅在綠豆中獲得預(yù)期的擴增產(chǎn)物。28種測試樣品為：(1)空白對照：水；(2)綠豆；(3)豌豆；(4)紅豆；(5)黃豆；(6)蠶豆；(7)長奶花豆；(8)花豆；(9)菜豆；(10)熊貓豆；(11)雀蛋豆；(12)大花黑蕓豆；(13)小白豆；(14)紫羅蘭豆；(15)大白豆；(16)竹花豆；(17)長熊豆；(18)扁豆；(19)青豆；(20)黑豆；(21)大黑豆；(22)豇豆；(23)玉米；(24)水稻；(25)小麥；(26)白芝麻；(27)黑芝麻；(28)花生。

檢出限LOD一般是指不低于95%的檢出情況下的綠豆含量，嚴(yán)格的測試試驗是在60次平行試驗中至少檢出59次陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

檢索、搜集到文獻中提供的綠豆普通PCR定性檢測方法[12]，經(jīng)分析和驗證獲得綠豆物種特異性序列mgQ062FRFLP。根據(jù)該特異性序列信息，應(yīng)用primer 3.0在線軟件(http://primer3.ut.ee/)設(shè)計綠豆源性成分定性PCR引物。PCR引物序列信息詳見表1，預(yù)期目的片段長度為470 bp和425 bp。

表 1 綠豆源性成分特異性引物序列信息Table 1 Specific primer sequences for mung bean

使用CTAB法提取綠豆等基因組DNA[12]，應(yīng)用通用的PCR反應(yīng)條件(DNA模板50 ng)，對2對引物進行特異性測試。從圖1可以看出，目的條帶長度為470 bp的引物未出現(xiàn)非特異性擴增，而由圖2可知，目的條帶長度為425 bp的引物對豌豆、豇豆均出現(xiàn)擴增條帶。因此，選擇Mungbean_470 bp_F/R引物進行后續(xù)的優(yōu)化分析。

圖1 Mungbean_470 bp_F/R引物特異性測試擴增結(jié)果Fig.1 Amplification results of Mungbean_470 bp_F/R

圖2 Mungbean_425 bp_F/R引物特異性測試擴增結(jié)果Fig.2 Amplification results of Mungbean_425 bp_F/R

2.2 PCR檢測體系參數(shù)的確立

調(diào)整、優(yōu)化PCR反應(yīng)程序，優(yōu)化退火溫度和引物濃度。結(jié)果表明(圖3)，Mungbean_470 bp_F/R引物在58 ℃退火溫度、0.4 μmol·L-1引物濃度下的擴增效果最優(yōu)。最終確定擴增反應(yīng)體為系25 μL： DNA模板(50 mg·L-1)1.0 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1)2 μL，Taq DNA聚合酶0.25 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)1.5 μL。PCR擴增程序為：95 ℃預(yù)變性5 min，35 個循環(huán)(95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s)，72 ℃延伸7 min，8 ℃保存。

圖3 PCR體系優(yōu)化結(jié)果Fig.3 PCR optimization results

2.3 靈敏度檢測

為了進一步測試建立的綠豆源性成分定性PCR檢測方法的靈敏度，設(shè)置8個不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(綠豆/小麥粉)的樣品，分別為100%、10%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%和0%，每組重復(fù)3次。結(jié)果表明，在PCR檢測反應(yīng)體系中加入50 ng DNA模板時，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5 %及以上的樣品擴增條帶明顯(圖4)。

圖4 方法靈敏度檢測結(jié)果Fig.4 Sensitivity test results

2.4 檢出限檢測

稱取了60份綠豆質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的樣品，提取基因組DNA，進行PCR擴增。結(jié)果如圖5所示，60份試樣中均能穩(wěn)定檢測出470 bp的預(yù)期DNA片段。上述結(jié)果表明,在該PCR檢測體系檢出限可達到0.5 %。

圖5 檢出限檢測結(jié)果Fig.5 Detection limit detection results

2.5 市售綠豆糕中綠豆源性成分定性檢測

稱取市售綠豆糕樣品200 mg，放入微量離心管中，通過CTAB方法[12]提取得到DNA，溶于100 mL TE溶液中，進行PCR擴增。以去離子水作為空白對照，產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果。結(jié)果表明，在與對照綠豆凝膠電泳圖譜相應(yīng)的位置上，綠豆在470 bp處有1條DNA條帶，空白對照(CK)無條帶，說明樣品中含綠豆成分(圖6)。空白對照和市售綠豆糕樣品各2個重復(fù)。

M: DNA Marker; CK:空白；1:綠豆糕樣品。 M:DNA Marker; CK:Control；1：Bean cake samples.

3 結(jié)論

本文探索設(shè)計了一種基于定性PCR的綠豆成分檢測方法。根據(jù)綠豆基因組特異性序列，設(shè)計PCR引物，并且對PCR反應(yīng)退火溫度、引物濃度等反應(yīng)體系進行優(yōu)化。結(jié)果表明，使用Mungbean_470 bp_F/R引物、在58 ℃退火溫度、0.4 μmol·L-1引物食品加工品成分檢測具有良好的可操作性，檢出限可達到0.5%。本方法屬于定性檢測方法，對于產(chǎn)品中是否添加豇豆、大豆等成分，亦可以采用對應(yīng)的引物對這些豆類進行檢測。采用PCR檢測法檢測綠豆成分，技術(shù)成熟、操作簡單。

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EstablishmentofspecificPCRformungbeaningredientsdetectioninfood

ZHAO Zhonglin1, LI Ruige1, QIN Zhiyang1,WANG Cheng2, WANG Yong2,YUAN Chao1,LAN Qingkuo2

(1.College of Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2.Institute of Tianjin Agriculture Quality Standard and Testing Technology，Tianjin 300381, China)

A specific PCR method was established for mung bean composition detection in food. Specific primers were designed to detect the gene from mung bean composition. Primer concentrations of 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 and 1.0 μmol·L-1and annealing temperature of 52, 54, 56, 58, 60 and 62 ℃were tested to optimize the reaction condition. We also tested the sensitivity, specificity, and detection limits of this method. The results showed that the best annealing temperature and primer concentration were 58 ℃ and 0.4 μmol·L-1, respectively. The sensitivity of detection was 0.5%. The method was simple, fast and easy to operate. Due to its high specificity, it could provide a basis for food safety assessment.

food; mung bean ingredients; gel electrophoresis; PCR ; specificity detection

2017-06-08

國家自然科學(xué)基金項目 (31100067)

趙仲麟(1980-)，男，遼寧鞍山人，副教授，博士，從事化學(xué)生物學(xué)及分子生物學(xué)方面的研究。

蘭青闊(1980-)，男，河南南陽人，副研究員，碩士。

1000-2340(2017)06-0867-04

TS214

A

蔣國良)