劉小莉 彭歡歡 趙江濤 夏秀東 劉 源 周劍忠*

1（江蘇省農業(yè)科學院農產品加工研究所，江蘇南京210014）

2（上海海洋大學食品學院，上海201306）

中華絨螯蟹是一種經濟蟹類，又稱河蟹、毛蟹、清水蟹、大閘蟹，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，是我國及東南亞地區(qū)人們十分鐘愛的淡水水產珍品，食用價值和經濟價值極高，成為特種水產品中最具代表性和最有影響力的主導產業(yè)，以江蘇為例，超百億的“螃蟹經濟”已占江蘇省水產品產值的40%以上。

由于河蟹是季節(jié)性非常強的水產品，只有在每年的農歷秋冬之際蟹才膏肥黃滿。河蟹集中上市季節(jié)，市場上經常出現(xiàn)大量積壓河蟹，根據民間傳統(tǒng)說法，河蟹一旦死亡便失去食用價值，嚴重影響河蟹產業(yè)經濟效益的提高。因此改變目前市場上單純供應鮮活河蟹的鮮銷方式，推進河蟹的儲藏和加工，對河蟹養(yǎng)殖業(yè)健康穩(wěn)定發(fā)展具有重要意義。

對于死亡河蟹不能食用的原因，解釋也不盡相同。有學者認為河蟹死亡初期體內會產生致病產物“肉毒堿”，但對肉毒堿的具體成分未見報道，也有學者認為死蟹失去食用價值，是因為河蟹為雜食性動物，以各種魚、蝦、螺、蚌、蠕蟲、蚯蚓、昆蟲及其幼蟲等為食物，因此體內含有大量的細菌，河蟹一旦死亡，體內的細菌就會大量繁殖，分解蟹肉，產生大量有毒生物胺，引起人體中毒。

目前，對于河蟹自然死亡后初期生物胺的變化有一些初步的研究和檢測。但對于企業(yè)用于加工的河蟹在較長儲貨期內是否安全，還沒有詳細報道。本研究采用高效液相色譜法研究室溫自然死亡、-40℃速凍后-20℃凍藏條件下的河蟹生物胺含量的變化，并結合pH值、揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）、游離氨基酸等指標分析河蟹相關品質的變化，從而為評價用于加工的凍藏河蟹的食品安全提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活公河蟹，由常熟市金唐市水產有限公司提供，體質量150 g±15 g，由江蘇省淡水水產研究所鑒定為中華絨螯蟹。

BCA法蛋白定量測試盒，南京建成生物工程研究所；色胺（Try）、腐胺（Put）、尸胺（Cad）、組胺（His）、酪胺（Tyr）、精胺（Spd）、亞精胺（Spe）標準品，sigma公司；氨基酸混合標樣，日本和光公司；丹磺酰氯、丙酮、乙腈（色譜純），南京化學試劑股份有限公司；其他試劑，均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

T25勻質分散機，德國IKA公司；SevenEasy plus pH儀，上海雷磁儀器廠；Waters 2096高效液相色譜儀，美國Waters公司；DW-150低溫試驗箱，南京泰斯特試驗設備；DW-4 OL 278醫(yī)用低溫保存箱，海爾集團；L-8900氨基酸全自動分析儀，日本日立公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料處理

鮮活河蟹用自來水沖洗干凈后瀝水，分組，分別進行處理：

1）自然死亡組：將河蟹直接置于室溫條件（25℃±3℃）下，至自然死亡；

2）冷凍儲藏組：設置低溫試驗箱溫度為-40℃，待腔體溫度穩(wěn)定至設定值后，將溫度探頭插入河蟹腹部中心進行凍結至中心溫度達-20℃以下，將凍結好的河蟹裝入保鮮自封袋（厚度0.2 mm），封口，-20℃低溫保存箱中儲藏。

定期取樣，于4℃冰箱中解凍后去除不可食部分，取河蟹腹部及足鉗內肉，用于指標測定。

1.3.2 pH值的測定

取蟹肉5 g，加入9倍體積（45 mL）煮沸冷卻后的純水，10 000 r/min勻漿30 s，10 000 r/min離心10 min，測定pH值。

1.3.3 揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）的檢測

采用GB/T 5009.44—2003半微量定氮法進行測定，略有改動。取樣品5 g，加入20 mL 5%高氯酸，10 000 r/min勻漿30 s，10 000 r/min離心10 min，取上清液。沉淀中再加入20 mL高氯酸重復上述提取步驟2次，合并上清液，定容到65 mL，用于TVB-N的測定。

1.3.4 游離氨基酸含量測定

采用氨基酸全自動分析儀進行測定。上述1.3.2中測完pH值的上清液，取適量，加10%三氯乙酸按1∶1稀釋，放置30 min后，離心取上清，過孔徑0.22 μm濾膜后供上機測定使用。

1.3.5 生物胺的檢測

用0.1 mol/LHCl溶解標準品，配成質量濃度為2 mg/mL的標準儲備液，稀釋為適當濃度，保存于棕色瓶中，4℃儲藏備用。

取待測樣品2.0 g，加10 mL（0.4 mol/L）高氯酸，10 000 r/min勻漿30 s，3 000 r/min離心10 min，取上清液。沉淀中再次加入10 mL（0.4 mol/L）高氯酸溶液，充分混勻，重復提取1次，合并2次上清液，用高氯酸（0.4 mol/L）溶液定容到25 mL，即為生物胺提取液，用于衍生化。

取標準溶液或提取液1 mL進行柱前衍生化處理。加入100 μL氫氧化鈉 （2 mol/L）溶液，300 μL飽和NaHCO3溶液和2 mL丹酰氯（丙酮溶解，10 mg/mL）溶液，于40℃反應 45 min；反應完畢，取出加入100 μL濃氨水，靜置30 min，加入乙腈定容至5 mL，振蕩混勻，取適量的溶液用孔徑0.22 μm濾膜過濾，采用高效液相色譜（HPLC）法進行生物胺測定。

HPLC檢測條件：Xtimate C18色譜柱(美國Welch公司)，檢測波長為254 nm，進樣量20 μL，柱溫30℃，流動相A為水，B為乙腈，梯度洗脫程序如表1所示。

表1 HPLC檢測流動相梯度洗脫程序

1.4 數(shù)據分析

本試驗數(shù)據為3次重復的平均值。采用SPSS13.0軟件進行數(shù)據統(tǒng)計和方差顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同儲藏過程中pH值、TVB-N值的變化

不同條件儲藏過程中蟹肉pH值和TVB-N值的測定結果見表2。由表2可以看出，河蟹肌肉pH值初始值為8.04，在儲藏前9 d內pH值變化不大，12 d時pH值急劇下降，這可能是因為前9 d河蟹處于鮮活狀態(tài)，12 d時河蟹已死亡，研究發(fā)現(xiàn)當動物呼吸停止時，血液停止循環(huán)引起供氧停止，組織呼吸轉變成無氧糖酵解途徑，體內糖原開始分解并產生乳酸，使肌肉的pH值下降。在冷凍儲藏過程中pH值呈下降趨勢，且前6周下降比較緩慢，12周下降比較快。與室溫貯藏相比，冷凍貯藏可以較長時間內維持河蟹肌肉的pH值。

揮發(fā)性鹽基氮含量（TVB-N值）可反映出蛋白質分解程度和腐敗程度。歐盟委員會法規(guī)及國內外多項研究建議水產品的TVB-N值可被消費者接受的最高濃度范圍為25 mg/100g～35 mg/100g。不同的水產品對于TVB-N值的要求不同，根據GB 2733—2005對鮮、凍動物性水產品衛(wèi)生要求的規(guī)定，不同水產品中TVB-N含量范圍為：海蟹≤25 mg/100g，海水貝類≤15 mg/100g，海水魚、蝦、頭足類≤30 mg/100g，淡水魚、蝦≤20 mg/100g，煌魚、牡蠣≤10 mg/100g。

由表2可知，處于鮮活狀態(tài)的河蟹TVB-N值變化不大，12 d后急劇上升，說明死亡的河蟹肌肉蛋白質發(fā)生分解造成肌肉的腐敗劣變。冷凍儲藏過程中，河蟹TVB-N值呈上升趨勢，但貯藏18周后TVB-N值仍低于20 mg/100g，說明凍藏儲存可以維持較低的TVB-N值，使河蟹保持較好的新鮮度。

表2 不同儲藏過程中蟹肉pH值和TVB-N值的變化

2.2 不同儲藏過程中游離氨基酸含量的變化

不同條件儲存過程中蟹肉游離氨基酸含量的測定結果見下頁表3。由表3可知，共檢出河蟹肌肉中游離氨基酸為19種，新鮮樣品中總氨基酸含量為19.361 mg/g，甘氨酸、丙氨酸、精氨酸和脯氨酸含量比較高，是蟹肉的主要呈味氨基酸。室溫下貯藏，蟹肉中總氨基酸含量在前9 d內沒有明顯的變化趨勢，12 d后下降到 10.194 mg/g，下降了47.4%，呈味氨基酸也明顯減少。凍藏過程中，蟹肉中總氨基酸隨時間的延長呈下降趨勢，下降速度比較緩慢，18周后下降了34%。貯藏過程中氨基酸成分和含量的變化可能是因為蟹肉蛋白質發(fā)生分解，結果表明凍藏可以有效延緩蛋白質的分解。

2.3 不同儲藏過程中生物胺含量的變化

生物胺（Biogenic Amine，BA）是一類具有生物活性的低分子質量含氮有機化合物的總稱，廣泛存在于生物體及多種食品當中。生物胺是生物體內的正?；钚猿煞?，在動植物和微生物活性細胞中發(fā)揮重要的生理作用。研究發(fā)現(xiàn)，適度的生物胺含量有益于健康，如兒茶胺、組胺等可以調節(jié)神經活動，控制血壓，但若攝入過量的生物胺，則會導致食物中毒。組胺被認為是最具有毒性的生物胺，被人們廣泛關注。有研究報道，尸胺、腐胺、酪胺、組胺為有毒生物胺，如尸胺、腐胺的半數(shù)致死量分別是270 mg/kg、1750 mg/kg；組胺口服8 mg～40 mg就可引起輕微的中毒，而超過100 mg會引起嚴重的中毒；酪胺口服超過100 mg時會引起偏頭疼，苯乙胺口服超過3 mg時會引起偏頭疼。

表3 不同儲藏過程中蟹肉游離氨基酸含量的變化

不同條件儲藏過程中蟹肉生物胺含量的測定結果見表4。表4結果顯示，新鮮的蟹肉中共檢測到3種生物胺，分別為腐胺、亞精胺和精胺，總生物胺含量為28.78 mg/kg。室溫下貯藏，前9 d蟹肉中總生物胺含量沒有明顯變化，6 d后有微量組胺生成，可能是組氨酸的分解作用，12 d后腐胺急劇增長，并有尸胺、大量組胺和酪胺的生成，總生物含量達到1 981.03 mg/kg。凍藏的河蟹隨著時間延長，總生物胺含量逐漸增加，12周有少量尸胺生成，18周后有少量酪胺生成，說明低溫貯藏可有效抑制螃蟹肌肉總生物胺含量以及腐胺、尸胺、酪胺的產生，延長貨架期。夏文水等人在河蟹死亡后新鮮度變化的研究中發(fā)現(xiàn)，死后的河蟹生物胺含量會迅速積累，而且組胺速度生成最快，河蟹死后在20℃條件下貯藏，3 h后組胺含量達到63.34 mg/kg，12 h后達到73.97 mg/kg，而在4℃條件下貯藏，24 h、72 h后組胺含量分別達到45.48 mg/kg和91.21 mg/kg。這說明河蟹死亡后生物胺含量上升速度很快，食用死蟹會出現(xiàn)食物中毒現(xiàn)象。

表4 蟹肉不同儲藏過程中的生物胺含量的變化

3 結論

本試驗研究了河蟹自然死亡組和冷凍儲藏組貯藏過程中蟹肉品質的變化，試驗結果表明，河蟹未死亡前pH值和TVB-N值無明顯變化，自然死亡后室溫條件下儲藏過程中河蟹的pH值、TVB-N值急劇上升，總氨基酸含量下降，總生物胺含量增加，達到1 981.03 mg/kg，且有尸胺、組胺和酪胺的生成。冷凍儲藏的河蟹其pH值和TVB-N值的變化顯著延緩，總氨基酸含量下降緩慢，生物胺含量有所增加，18周后僅達到41.20 mg/kg，說明凍藏可以有效延緩各指標的變化，延長貨架期，保證食用安全性。

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