劉冬陽(yáng)，李維娟

(1.重慶市中醫(yī)院，重慶，400011；2.重慶市兩江新區(qū)第一人民醫(yī)院，重慶，401121）

組織工程皮膚可以修復(fù)創(chuàng)面，可以作為一種生物替代物，其基本組成成分是細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)，也可由兩者結(jié)合而成。近年來(lái)，工程學(xué)和生命科學(xué)的原理與技術(shù)發(fā)展迅速，對(duì)組織工程皮膚的研究起到越來(lái)越重要的作用。在皮膚組織工程研究中，支架材料和種子細(xì)胞的研究非常重要，支架材料和種子細(xì)胞是構(gòu)成組織工程皮膚關(guān)鍵的兩個(gè)部分，目前多種組織工程相關(guān)的皮膚產(chǎn)品已在臨床實(shí)踐中得到應(yīng)用［1］。

關(guān)于組織工程皮膚的種子細(xì)胞，目前有關(guān)這方面的研究很多，尤其在干細(xì)胞的研究方面，例如脂肪干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等。構(gòu)建具有生物活性的皮膚非常重要，這樣對(duì)創(chuàng)面才能起到完美修復(fù)的作用，這樣就需要重點(diǎn)考慮種子細(xì)胞的來(lái)源問(wèn)題，并且其如何進(jìn)行分離及怎么增殖分化也非常重要。

1 BMSCs與皮膚組織工程相關(guān)的生物學(xué)特性

1.1 BMSCs的來(lái)源及其分離

BMSCs來(lái)源豐富，主要存在于骨髓、骨膜、胸腺、皮膚、脂肪、肌肉、臍帶、臍血等[2-3]。同樣的，目前BMSCs的分離方法也有很多種，目前已知的主要有紅細(xì)胞溶解法、全骨髓貼壁法、免疫磁珠分選法、Ficoll密度梯度離心分離法等。祝旭龍等運(yùn)用骨髓貼壁這種方法來(lái)分離大鼠的BMSCs，首先，在細(xì)胞初期培養(yǎng)階段，培養(yǎng)液給予多次更換；其次，在細(xì)胞傳代過(guò)程中盡可能減少胰蛋白酶的暴露時(shí)間，從而達(dá)到使BMSCs純化的目的，通過(guò)以上方法，可以既簡(jiǎn)單、又效率高的分離出形態(tài)一致的大鼠BMSCs[4]。然而也有實(shí)驗(yàn)證明利用Ficoll分離液獲得的BMSCs比其他方法獲得的細(xì)胞原性更好、純度更高，所以能在誘導(dǎo)后有更高水平的分化能力，在創(chuàng)傷修復(fù)和組織工程中可以更好的應(yīng)用[5-6]。

1.2 BMSCs的表達(dá)標(biāo)志物

根據(jù)現(xiàn)階段的研究，BMSCs缺乏特異的標(biāo)志物，BMSCs的鑒定可以通過(guò)形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能特性，結(jié)合多表型細(xì)胞標(biāo)志物完成。有研究表明，BMSCs可以表達(dá)CD29和CD44，這兩者是干細(xì)胞的標(biāo)志物，而不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)志CD45和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志CD31［7-8］。池凱等應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs表面抗原CD44、CD73、CD105、CD34的表達(dá)分別為99.54%、90.21%、96.43%、0.18%，CD44、CD73、CD105陽(yáng)性表達(dá)，CD34陰性表達(dá)[9]。

1.3 BMSCs的調(diào)控和增殖分化

BMSCs是成體干細(xì)胞的一種, 誘導(dǎo)條件不同，轉(zhuǎn)變的細(xì)胞也不相同，有相關(guān)研究表明BMSCs可以向神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和骨細(xì)胞等不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)化[10-11]。BMSCs不但具備顯著的多向分化潛能，而且具有自我更新能力，研究表明年齡因素不會(huì)影響上述這些特征［12］。微環(huán)境對(duì)BMSCs的分化方向影響很大，研究證實(shí)BMSCs在再生皮膚中可分化為皮脂腺管細(xì)胞和表皮細(xì)胞，如果放在肉芽組織中，那么BMSCs可增殖分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，可見(jiàn)微環(huán)境的重要性［13］。Centola.M等將BMSCs 貼附于不斷釋放肝素的新型生物支架，從而將BMSCs 誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞[14]。

2 BMSCs與皮膚組織工程創(chuàng)面修復(fù)

外傷引起的皮膚缺損，皮膚的再生僅靠創(chuàng)面自身很難實(shí)現(xiàn)。王少云等先制作兔糖尿病皮膚缺損模型，采用BMSCs與豬小腸黏膜下層膜復(fù)合構(gòu)建組織工程皮膚，通過(guò)后期觀察發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組及小腸粘膜下層組組織生長(zhǎng)速度較慢，而實(shí)驗(yàn)組組織生長(zhǎng)明顯較快，得出結(jié)論：通過(guò)組織工程技術(shù)得到的復(fù)合皮膚用于修復(fù)皮膚組織缺損有明顯的優(yōu)越性[15]。房林將BMSCs于切口兩側(cè)距切口線0.5 cm處圍繞切口分10點(diǎn)皮下注射到創(chuàng)傷大鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植組切口組織壞死程度小于對(duì)照組，且血管生成明顯，細(xì)胞外基質(zhì)成熟速度快于對(duì)照組，證實(shí)BMSCs可促進(jìn)傷口愈合[16]。王和庚等研究發(fā)現(xiàn)，大鼠皮膚慢性潰瘍處給予4種不同的治療方案,并分為四組，依次是異體BMSCs懸液聯(lián)合PRP治療組（A組）、單純注射異體BMSCs懸液組（B組）、單純注射PRP治療組（C組）、注射等量生理鹽水組（D組），治療后 7、14發(fā)現(xiàn)，A組、B組及C組創(chuàng)面愈合時(shí)間均少于D組，并且發(fā)現(xiàn)A組愈合時(shí)間比 B、C 組縮短。并通過(guò)組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)A組新生真皮相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的厚度、膠原纖維等均明顯多于其他各對(duì)照組，進(jìn)而得出結(jié)論：聯(lián)合應(yīng)用異體BMSCs和自體PRP，能加快真皮的修復(fù)和重建，促進(jìn)創(chuàng)面的修復(fù)[17]。張貝瑩等先制作犬皮膚創(chuàng)傷模型，犬的肩胛及臀部左右兩側(cè)分為對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組在創(chuàng)面皮下注射異體犬的BMSCs懸液，通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)對(duì)照組創(chuàng)面愈合速度慢于實(shí)驗(yàn)組，得出結(jié)論：犬BMSCs移植在加速皮膚創(chuàng)面愈合方面，有可能或者趨勢(shì)[18]。

2.1 分化為皮膚的功能細(xì)胞

BMSCs既具有自我更新能力，又有多向分化能力，并且這些優(yōu)勢(shì)可長(zhǎng)期保持，BMSCs能夠在創(chuàng)面局部增殖分化為修復(fù)創(chuàng)面所需的各種類型細(xì)胞，已知的有汗腺細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、皮脂腺細(xì)胞等［19-20］。龍劍虹等采用直接貼壁法獲得BMSCs后，然后將其在細(xì)胞培養(yǎng)上清液及含有表皮生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)分化，通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)整合素β1和CK19同時(shí)表達(dá)的細(xì)胞很多，得出 BMSCs可以分化為表皮干細(xì)胞的結(jié)論［21］。王漢群等通過(guò)研究，應(yīng)用5-溴脫氧尿嘧啶（BrdU）將自體BMSCs標(biāo)志后,觀察發(fā)現(xiàn)具有BMSCs的治療組的愈合時(shí)間快于對(duì)照組，并且治療組的創(chuàng)面收縮率也要大于對(duì)照組，通過(guò)計(jì)算發(fā)現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，治療組再生的皮膚細(xì)胞數(shù)目明顯多于對(duì)照組，并且其皮膚的表皮層厚度顯著大于對(duì)照組，進(jìn)而認(rèn)為[BMSCs有分化為表皮細(xì)胞的可能，并可以加速創(chuàng)面修復(fù)［22］。Mei等對(duì)BMSCs在體外進(jìn)行誘導(dǎo)分化，經(jīng)過(guò) 120-180天的誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞逐漸趨向黑色素細(xì)胞的形態(tài)，并且觀測(cè)到細(xì)胞內(nèi)明顯的黑色素沉積，證明了BMSCs 可以在特定的條件下分化為皮膚相關(guān)細(xì)胞[23]。

2.2 分泌功能

目前有研究認(rèn)為，BMSCs 在修復(fù)組織的過(guò)程中，其改變組織微環(huán)境的能力可能比分化轉(zhuǎn)移的能力發(fā)揮更大的作用［24］。Liu Yongbo等用RT-PCR和ELISA等方法檢測(cè)顯示在創(chuàng)傷微環(huán)境作用下BMSCs可分泌TGF-131、EGF、VEGF、PDGF、KGF、FGF、HGF等，在創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中，上述這些生長(zhǎng)因子非常重要[25]。Wu 等將BMSCs注射到創(chuàng)面周圍，發(fā)現(xiàn)在正常和糖尿病鼠中，BMSCs能分化和釋放血管生成因子前體，從而顯著加快創(chuàng)傷的愈合［26］。

2.3 其他功能

鐘曉紅等以大鼠為模型，直接對(duì)大鼠創(chuàng)面注射BMSCs，發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面瘢痕增生減輕，愈合質(zhì)量提高［27］。Baraniak等研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs可能有促進(jìn)體內(nèi)干細(xì)胞向傷口局部遷移、減少纖維化、降低細(xì)胞凋亡、維持細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等作用［28］。

3 展 望

BMSCs在皮膚組織工程的應(yīng)用還需要進(jìn)一步研究，首先，BMSCs鑒定及純化方法有待進(jìn)一步完善；其次，BMSCs在機(jī)體內(nèi)外作用機(jī)制需要更深入的探討；再者，BMSCs在皮膚組織工程基因治療中的應(yīng)用。這些都將是以后研究工作的重點(diǎn)內(nèi)容,相信隨著生物技術(shù)的發(fā)展及干細(xì)胞研究的逐漸深入，BMSCs在皮膚組織工程中的應(yīng)用會(huì)越來(lái)越廣泛。