馬鑫 濮劍辰 李婷 許穎 范春雷 田男

浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 杭州 310053

人腦膠質(zhì)瘤（glioblastoma）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤。因其與正常腦組織沒有明確界限，使用傳統(tǒng)手術(shù)方法難以達(dá)到根除目的，同時(shí)由于血腦屏障的存在，化療等治療手段難以奏效，患者5年生存率不足5%[1-4]。目前腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但越來越多的研究表明，血管化是實(shí)體腫瘤發(fā)展進(jìn)程中的重要組成部分，腫瘤新生血管為實(shí)體腫瘤提供生長所需的營養(yǎng)和氧氣，同時(shí)清除腫瘤細(xì)胞的代謝廢物，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[5-9]。因此探索腫瘤血管生成的調(diào)控分子可為膠質(zhì)瘤治療提供新方向。

近年來，關(guān)于細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）與腫瘤關(guān)系的研究已成為當(dāng)前研究的一大熱門。腫瘤細(xì)胞分泌的EVs能夠傳遞信息到其它腫瘤細(xì)胞以及正常基質(zhì)細(xì)胞，營造適合腫瘤生長的微環(huán)境，促進(jìn)血管生成、腫瘤生長發(fā)展以及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[10-12]。Giusti等[13]發(fā)現(xiàn)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌的EVs在血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移以及成管的過程中有重要作用。研究還發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNAs（long non-coding RNAs,lncRNAs）在膠質(zhì)瘤血管新生中扮演重要角色[14-15]。Rinn課題組發(fā)現(xiàn)了 HOX轉(zhuǎn)錄反義 RNA（HOX transcript antisense intergenic RNA,HOTAIR），其表達(dá)與膠質(zhì)瘤的級(jí)別和預(yù)后生存均密切相關(guān)，是獨(dú)立于病理診斷指標(biāo)之外的膠質(zhì)瘤患者預(yù)后指標(biāo)[16-17]。眾多研究證實(shí)，HOTAIR在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的高表達(dá)，與膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、糖酵解和線粒體功能密切相關(guān)[16,18-20]，但HOTAIR在膠質(zhì)瘤血管新生中的作用，以及HOTAIR與EVs的關(guān)系至今不明。因此，本研究通過沉默膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的HOTAIR基因，觀察其對(duì)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（human brain microvascular endothelial cells,HBMVEC）增殖、遷移和血管形成能力的影響，同時(shí)進(jìn)一步研究膠質(zhì)瘤細(xì)胞中HOTAIR與EVs的關(guān)系，探討HOTAIR參與膠質(zhì)瘤血管新生的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞與主要試劑 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和HBMVEC均購自中科院上海細(xì)胞所。DMEM高糖培養(yǎng)液、無支原體胎牛血清和含0.25%EDTA胰酶均購于杭州昊天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：2016122902、20160712、20161019）；噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyltetrazolium bromide，MTT）購于杭州昊天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：3068B512）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購于美國 Sigma公司（批號(hào)：67-68-5）；姬姆薩染液（Giemsa stain）購自上海源葉生物科技有限公司（批號(hào)：L16F8G29355）。Trizol購于美國Invitrogen公司（批號(hào)：127706）；游離RNA提取試劑盒RNApure Circulating Reagent Kit購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司（批號(hào)：01731/60138）；HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司（批號(hào)：40129）；Ultra SYBR熒光定量試劑盒購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司（批號(hào)：40140）。Lipofectamine2000 Reagent購于美國 Invitrogen公司（批號(hào)：1704478），Triton X-100購于美國Sigma公司（批號(hào)：92046-34-9），引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成，過表達(dá)質(zhì)粒LZRSHOTAIR購自美國addgene公司。

1.1.2 儀器 恒溫恒濕培養(yǎng)箱為美國Thermo公司產(chǎn)品；熒光定量PCR儀為美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品；多功能酶標(biāo)儀購于美國Molecular Devices公司；倒置光學(xué)顯微鏡及成像系統(tǒng)為日本Nikon公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) U87細(xì)胞和HBMVEC均采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，置于37°C、5%細(xì)胞CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 U87細(xì)胞培養(yǎng)上清液的收集 將U87細(xì)胞傳代后接種于6孔板，培養(yǎng)于37°C、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)，24h后觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，將原細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至離心管中，4°C、5 000r/min離心20min，離心后取上清液，分裝后-80°C保存。

1.2.3 脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞 U87細(xì)胞傳代培養(yǎng)至生長密度為30%～50%時(shí)用于轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞分為4組：無意義RNA對(duì)照組（siGFP組）、siRNA陰性對(duì)照組（si-NC組）、siHOTAIR組、回復(fù)組（Rescue組）。轉(zhuǎn)染按照說明書方法進(jìn)行，回復(fù)組采用HOTAIR siRNA與過表達(dá)質(zhì)粒LZRS-HOTAIR共轉(zhuǎn)染（按3:5比例混合）。U87細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，繼續(xù)置于 37°C、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。轉(zhuǎn)染24h后收集細(xì)胞，于4℃、5 000r/min離心20min，離心后取上清液，分裝后-80℃保存。

1.2.4 U87細(xì)胞培養(yǎng)上清液處理和RNA提取 取轉(zhuǎn)染前U87細(xì)胞培養(yǎng)上清液4mL，分為空白組、RNase組、Triton X-100組、RNase和Triton X-100聯(lián)合組?？瞻捉M不作處理，RNase組加入2mg·mL-1RNase 1mL，Triton X-100組加入 0.1%Triton X-100 1mL，RNase和Triton X-100聯(lián)合組則分別加入2mg·mL-1RNase和0.1%Triton X-100各1mL，孵育20min。根據(jù)試劑盒說明書提取上清液中的RNA，5 000r/min離心10min，除去死細(xì)胞，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入3倍體積的游離RNA提取試劑。震蕩30s使之充分混勻。將處理后的樣品在室溫放置5min，使蛋白核酸復(fù)合物完全分離。加入800μL氯仿，蓋好管蓋，劇烈震蕩 15s，室溫放置 2～3min。4°C、12 000r/min離心20min，此時(shí)樣品分成紅色有機(jī)相、中間層和上層無色水相3層。因RNA主要在水相中，故把水相轉(zhuǎn)移到新的無RNase的離心管中，在得到的水相溶液中加入等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫放置30min。4°C、12 000r/min離心20min，棄去上清液。加入75%乙醇（用無RNase的水配制）洗滌沉淀，1mL游離RNA提取試劑加入1mL 75%乙醇。4°C、12 000r/min離心3min，小心棄去上清液，注意不要棄去RNA沉淀。室溫放置 2～3min，晾干。加入 30～100μL 無 RNase水充分溶解RNA，-80°C保存，防止降解。

1.2.5 熒光定量PCR檢測(cè)各組U87細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HOTAIR基因含量 取轉(zhuǎn)染24h后的U87細(xì)胞，用Trizol試劑提取總RNA后，根據(jù)HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒說明書，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。熒光定量PCR擴(kuò)增，內(nèi)參基因及目的基因引物序列見表1。擴(kuò)增條件：95°C 預(yù)變性 10min，95°C 變性 15s、60°C退火1min，72°C延伸30s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。采用比較CT值的方法計(jì)算樣本中mRNA的表達(dá)水平。Ratio=2-△△Ct，△Ct=目的基因 CT 值-內(nèi)參基因 CT 值，△△Ct=△Ct實(shí)驗(yàn)組-△Ct對(duì)照組。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.6 MTT法和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞HBMVEC增殖情況

1.2.6.1 MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后U87細(xì)胞上清液對(duì)HBMVEC增殖的影響 用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液懸浮HBMVEC，然后將HBMVEC以3×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板，每孔總體積為100μL。設(shè)置siGFP組、si-NC組、siHOTAIR組和回復(fù)組，每組6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)4～6h后將原培養(yǎng)液分別替換為siGFP組、si-NC組、siHOTAIR組和回復(fù)組轉(zhuǎn)染后的U87細(xì)胞上清液，再次孵育。孵育6h、12h和24h后，每孔加入20μL濃度為5mg·mL-1的MTT，避光孵育4 h后棄培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO，置于水平搖床震蕩混勻15min。將酶標(biāo)儀的吸收波長設(shè)定為490 nm，測(cè)定每孔的OD值。細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.2.6.2 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期的HBMVEC制成單細(xì)胞懸液，以5×102個(gè)/孔的密度接種于6孔板，設(shè)置si-NC組和siHOTAIR組，置于37°C、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，12h后將培養(yǎng)液分別替換為轉(zhuǎn)染后si-NC組和siHOTAIR組的U87細(xì)胞上清液，2～3d換液1次。14d后棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定30min，再以Giemsa染液染色15min。緩慢沖洗掉染液后鏡下觀察拍照并計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)。

1.2.7 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染24h后的U87細(xì)胞接種于含600μL無血清培養(yǎng)液的Transwell小室的下層，含100μL無血清培養(yǎng)液的HBMVEC懸液置于小室的上層，于37°C、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)孵育12h。取出小室，用4%多聚甲醛室溫固定小室底部聚碳酸酯微孔膜上的細(xì)胞30min，Giemsa染液染色15min。緩慢沖洗掉染液，棄掉上室未固定的細(xì)胞。光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照，計(jì)數(shù)每個(gè)小室特定視野下穿過聚碳酸酯微孔膜底部的細(xì)胞數(shù)，進(jìn)行組間比較。

1.2.8 HBMVEC體外成管實(shí)驗(yàn) 將基質(zhì)膠置于4℃條件下凍融過夜。設(shè)置陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，在預(yù)冷的 96孔板中每孔加入 75μL基質(zhì)膠，37°C放置60min。將HBMVEC懸液以2.5×104個(gè)/孔的密度加入96孔板對(duì)應(yīng)孔中，待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)液替換為轉(zhuǎn)染后的U87細(xì)胞上清液繼續(xù)孵育。4～6h后，鏡下選取合適視野進(jìn)行觀察拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以±s表示，常規(guī)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 沉默HOTAIR基因?qū)BMVEC增殖的影響熒光定量PCR結(jié)果顯示，siHOTAIR組U87細(xì)胞的HOTAIR表達(dá)水平明顯低于si-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），回復(fù)組HOTAIR表達(dá)水平明顯高于siHOTAIR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖1A。MTT染色結(jié)果顯示，用轉(zhuǎn)染后U87細(xì)胞培養(yǎng)上清液孵育HBMVEC后，與si-NC組比較，siHOTAIR組細(xì)胞上清液孵育的HBMVEC增殖活力降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而與siHOTAIR組相比，回復(fù)組孵育的HBMVEC增殖活力顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖1B。提示HOTAIR能夠特異性調(diào)控HBMVEC增殖。進(jìn)一步的克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siHOTAIR組HBMVEC形成克隆數(shù)量少于si-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖1C和1D。

2.2 沉默HOTAIR基因?qū)BMVEC遷移的影響細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，siHOTAIR組U87細(xì)胞誘導(dǎo)的HBMVEC遷移數(shù)量少于si-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見圖2A和2B。

圖1 沉默HOTAIR基因?qū)BMVEC增殖的影響Fig.1 The influence of knockdown HOTAIR gene on HBMVEC proliferation

2.3 沉默HOTAIR基因?qū)BMVEC細(xì)胞成管的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siHOTAIR組U87細(xì)胞誘導(dǎo)的HBMVEC細(xì)胞成管數(shù)量明顯少于si-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見圖3A和3B。

2.4 HOTAIR基因與U87細(xì)胞分泌EVs的關(guān)系 熒光定量PCR結(jié)果顯示，空白組、RNase組、Triton X-100組3組間HOTAIR基因表達(dá)量無明顯差異（P>0.05），而RNase和Triton X-100聯(lián)合組 HOTAIR基因表達(dá)量則顯著低于其余3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見圖4。

圖2 siHOTAIR轉(zhuǎn)染上清液對(duì)HBMVEC遷移的影響Fig.2 The influence of transfect supernatant on migration of HBMVEC

圖3 HBMVEC成管圖片（200×）Fig.3 The tubes formation of HBMVEC maps(200×)

圖4 U87細(xì)胞分泌的EVs中HOTAIR表達(dá)水平Fig.4 The expression levels of HOTAIR in extracellular vesicles derived by U87 cells

3 討論

lncRNAs是一類轉(zhuǎn)錄長度大于200nts、不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子，可在轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)，參與多種生物學(xué)活動(dòng)[21-24]。越來越多的研究表明，lncRNAs與腫瘤之間存在密切關(guān)系，在腫瘤發(fā)生、腫瘤血管生成以及腫瘤遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移等發(fā)展進(jìn)程中扮演重要角色[25-29]。腫瘤血管生成與腫瘤生長密切相關(guān)，實(shí)體腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移過程高度依賴腫瘤新生血管[30]。Jia等[31]研究證實(shí)，H19可通過抑制miRNA-29a從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤血管生成和膠質(zhì)瘤相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)行為。Zhu等[32]研究發(fā)現(xiàn)肝癌高表達(dá)轉(zhuǎn)錄（highly up-regulated in liver cancer,HULC）基因通過磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B,PKB）/雷帕霉素靶向基因（mammalian target of rapamycin,mTOR）信號(hào)通路調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子-1（endothelial cell specific molecule-1,ESM-1）表達(dá)，從而參與膠質(zhì)瘤血管生成。但HOTAIR在膠質(zhì)瘤血管生成中的作用及其可能的分子機(jī)制尚未見于報(bào)道。本研究通過RNA干擾試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沉默U87細(xì)胞中HOTAIR基因表達(dá)對(duì)HBMVEC增殖存在抑制作用，同時(shí)設(shè)立回復(fù)組以排除RNAi中的脫靶效應(yīng)，反向驗(yàn)證HOTAIR基因表達(dá)對(duì)HBMVEC增殖的影響。克隆形成、細(xì)胞遷移和體外成管實(shí)驗(yàn)也證實(shí)HOTAIR在U87細(xì)胞誘導(dǎo)HBMVEC增殖、遷移以及成管過程中具有調(diào)控作用，進(jìn)一步提示HOTAIR參與了膠質(zhì)瘤血管新生過程。

大量研究表明，EVs在腫瘤血管生成過程中發(fā)揮重要作用，腫瘤細(xì)胞通過向細(xì)胞外分泌大量EVs進(jìn)行細(xì)胞間信息交流，并創(chuàng)建適合腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的微環(huán)境[33]。Gezer等[34]研究發(fā)現(xiàn)，在人宮頸癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞分泌的EVs中富含HOTAIR、長鏈非編碼RNA-p21（long non-coding RNA-p21，lncRNA-p21）、長鏈非編碼RNA-細(xì)胞周期蛋白D1（long non-coding RNA-cyclind1，lncRNA-CCND1）等 RNA 分子。越來越多的研究表明，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以分泌大量EVs促進(jìn)腫瘤生長及發(fā)展[35-37]。為了探索HOTAIR是否存在于U87細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的EVs中，本研究首先通過熒光定量PCR證實(shí)在U87細(xì)胞上清液中存在HOTAIR分子，其次用去污劑Triton X-100和RNase證實(shí)細(xì)胞上清液中的HOTAIR分子受膜性囊泡保護(hù)。結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，筆者推測(cè)沉默HOTAIR基因可以抑制U87細(xì)胞促血管生成活性，而HOTAIR分子可能存在于U87細(xì)胞分泌的EVs中，參與調(diào)控膠質(zhì)瘤血管生成。

綜上所述，腫瘤新生血管是腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移過程中不可或缺的重要組成部分，沉默HOTAIR基因可以抑制HBMVEC增殖、遷移以及成管能力。在后續(xù)研究中，筆者將從膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液和患者血漿中分離EVs，并鑒定與HOTAIR相關(guān)的EVs的類型，進(jìn)一步研究HOTAIR在膠質(zhì)瘤血管生成中的作用及其可能的機(jī)制。

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