覃宇周 賴浩 黃名威 吳留成 陽揚 鐘華戈

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胃腸外科

SEPT9廣泛分布于真核細(xì)胞，其產(chǎn)物屬于GTP結(jié)合蛋白，生理功能主要是參與維持細(xì)胞骨架以及調(diào)控囊泡運輸、細(xì)胞極性、細(xì)胞分裂和細(xì)胞凋亡等生理過程。甲基化SEPT9在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本文就外周血甲基化SEPT9檢測在惡性腫瘤診斷、監(jiān)測應(yīng)用中的研究進展作一綜述。

1 SEPT9基因概述

SEPT9基因是septin基因家族成員之一，位于人類染色體17q25.3，長度約24×103bp，包含17個外顯子。SEPT9至少有18種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，編碼包括長型（SEPT9_v1、SEPT9_v2、SEPT9_v3）、中等型（SEPT9_v4、SEPT9_v4*）和短型（SEPT9_v5）等 15 種多肽［1］。除胸腺及腦組織外，其編碼的septin蛋白在其他組織中均有分布［2］。通過對SEPT9進行生化結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，SEPT9的生理功能主要通過中央?yún)^(qū)域的鳥核苷酸相互作用序列與部分主要細(xì)胞骨架成分相互作用，召集其他蛋白至細(xì)胞質(zhì)的特定位點，而在細(xì)胞增殖、分裂、運動以及調(diào)節(jié)微血管、轉(zhuǎn)運等方面起重要作用。在細(xì)胞分裂末期，如SEPT9受到小干擾RNA影響，將導(dǎo)致細(xì)胞不能完全分裂，最終產(chǎn)生雙核或多核細(xì)胞［3］。

DNA甲基化是蛋白質(zhì)和核酸的一種重要修飾，調(diào)節(jié)基因表達和關(guān)閉，與惡性腫瘤、衰老、老年癡呆等多種疾病密切相關(guān)。DNA甲基化包括高甲基化和低甲基化，通常認(rèn)為高甲基化可導(dǎo)致基因沉默、蛋白表達降低。DNA甲基化檢測因此被應(yīng)用于腫瘤診斷及預(yù)后判斷、監(jiān)測［4-5］。SEPT9甲基化可導(dǎo)致基因表達異常，引起細(xì)胞分裂異常和癌變。SEPT9在乳腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌等腫瘤均有表達，在不同組織來源腫瘤中的表達存在差異［6-7］，但SEPT9_v2啟動子高甲基化是結(jié)直腸癌形成過程的特有表現(xiàn)［8］，說明甲基化SEPT9可能是腫瘤形成的啟動因子，而DNA甲基化可能是調(diào)節(jié)SEPT9不同轉(zhuǎn)錄本差異表達的機制之一［9］。

2 外周血甲基化DNA及檢測方法

外周血游離DNA是在外周血中發(fā)現(xiàn)的與任何細(xì)胞碎片均無關(guān)聯(lián)的DNA，通常從細(xì)胞脫落，包括白細(xì)胞、癌細(xì)胞。從癌細(xì)胞脫落的游離DNA不僅與癌細(xì)胞有相同的突變，也存在同樣的甲基化改變［10］。研究表明，多數(shù)腫瘤患者的循環(huán)DNA濃度呈不同程度升高［11］。因此，基于外周血游離DNA中的腫瘤特異性甲基化檢測是一種潛在的非侵入性、基于血液分析的腫瘤診斷手段［12］。過去十多年，DNA甲基化檢測技術(shù)已取得顯著進步，有多種不同的檢測技術(shù)，主要通過三種途徑：甲基化特異性限制性內(nèi)切酶、甲基化DNA的親和純化和DNA的亞硫酸酯轉(zhuǎn)化［13］。目前，多數(shù)方法依賴于亞硫酸氫鹽的DNA轉(zhuǎn)化及延伸的PCR方法，包括MethylationspecificPCR（MSP-PCR）、SMART-MSP、MethyLight、Methylation-sensitive high resolution melting（MS-HRM）、Sanger sequencing of bisulfite treated DNA、Pyrosequencing、Next generation sequencing、Mass-ARRAY EpiTYPER等8種。以上檢測技術(shù)各有優(yōu)缺點，如何選擇合適的檢測技術(shù)很大程度上取決于樣本數(shù)量、所需信息以及成本等［14］。

3 外周血甲基化SEPT9與惡性腫瘤

甲基化SEPT9存在于多種惡性腫瘤組織中，隨著甲基化DNA檢測方法不斷改進和優(yōu)化，圍繞甲基化SEPT9檢測也在多種腫瘤中展開研究，尤其是基于外周血的檢測研究，但目前大多研究關(guān)于結(jié)直腸癌，在其他惡性腫瘤中的研究還處于起步階段。鑒于表觀遺傳學(xué)的發(fā)展以及外周血甲基化SEPT9在結(jié)直腸癌研究取得的成果，不少學(xué)者也開始在其他癌種開展研究。

3.1 結(jié)直腸癌

表觀遺傳學(xué)研究表明，DNA異常甲基化是散發(fā)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的早期事件。2008年Lofton-Day等［15］證實結(jié)腸癌組織SEPT9啟動子存在不同程度甲基化。生物標(biāo)志物在結(jié)直腸癌組織與外周血的高度一致性，使液體活檢技術(shù)在結(jié)直腸癌診斷中的研究得以迅速發(fā)展［16］。Ladabaum 等［17］比較幾種結(jié)直腸癌篩查方法，包括外周血甲基化SEPT9檢測、糞便隱血試驗（fecal occult blood test，F(xiàn)OBT）和糞便免疫化學(xué)試驗（fecal immunochemical testing，F(xiàn)IT），發(fā)現(xiàn)外周血甲基化SEPT9檢測的檢出率為35%～41%，且更經(jīng)濟、依從性更高。其他研究亦認(rèn)為其可作為結(jié)直腸癌診斷的輔助手段［18-19］。而有研究發(fā)現(xiàn)外周血甲基化SEPT9檢測較糖蛋白標(biāo)志物（CEA、CA199、CA242、CA72-4 和CA125）更敏感，以上標(biāo)志物單獨檢測的敏感度為18.8%～52.2%，5項指標(biāo)聯(lián)合的敏感度、特異度分別為85.3%、95.0%，與單獨外周血甲基化SEPT9檢測效果相似［20］。因此，Church 等［21］牽頭開展了 PRESEPT 研究，納入7 900余例患者，其中結(jié)直腸癌53例，外周血甲基化SEPT9檢測的敏感度為48.2%，特異度為91.5%。需要指出的是，該研究收集的標(biāo)本均來自有癥狀的患者，可能使總體敏感度下降，甚至低于較早開展的幾項研究的敏感度（67.0%～79.3%）和特異度（86%～99%）［19，22-23］。而其他甲基化基因，不管是基于糞便還是血液檢測，均沒有甲基化SEPT9敏感［16，24］。

甲基化SEPT9聯(lián)合其他檢驗方法可提高結(jié)直腸癌診斷的敏感度和特異度。He等［25］聯(lián)合檢測ALX4、SEPT9和TMEFF2等基因甲基化的表達，發(fā)現(xiàn)血液標(biāo)本診斷結(jié)直腸癌的敏感度和特異度高于組織標(biāo)本，分別為87%、90%。聯(lián)合其他基因（包括ALX4、BMP3、NPTX2、RARB、SDC2和 VIM等）檢測的研究亦得到相似結(jié)論［4］，而聯(lián)合SEPT9、SHOX2檢測可提高結(jié)直腸癌在腺瘤、炎癥性腸病的檢出率［26］。在各期結(jié)直腸癌中，Ⅰ期甲基化SEPT9陽性率大約為30%、Ⅱ～Ⅲ期為50%～70%、Ⅳ期為70%～100%，隨分期增加，甲基化SEPT9陽性率有升高趨勢，但各研究數(shù)據(jù)差異較大［15，18，21，27-28］。目前 2 項研究［28-29］關(guān)注外周血甲基化SEPT9應(yīng)用于術(shù)后監(jiān)測，給結(jié)直腸癌術(shù)后療效評估和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移檢測提供了新思路。但由于人口統(tǒng)計學(xué)特征、病理特征、檢測技術(shù)等因素導(dǎo)致樣本異質(zhì)性較大，以及篩查成本效益考量、結(jié)腸腺瘤和癌前息肉病變檢測準(zhǔn)確性有待提高等問題［30］，且甲基化SEPT9陽性率受多種因素的影響，比如早期疾病、年齡＞65歲、糖尿病、關(guān)節(jié)炎和動脈硬化等［31］，是否具有種族差異亦未明確［28］。因此，外周血SEPT9甲基化檢測的臨床可用性仍有限。

3.2 胃癌

Lee等［28］收集了153例胃癌患者的外周血樣本，發(fā)現(xiàn)外周血甲基化SEPT9檢測的敏感度為17.7%，特異度為90.6%。隨訪期間，觀察到外周血甲基化SEPT9陽性患者有遠處轉(zhuǎn)移傾向，無病生存率較低。亞組分析顯示，腸型（23.5%）、混合型（40.0%）患者的外周血甲基化SEPT9陽性率較彌漫型（7.3%）更高。而外周血甲基化SEPT9聯(lián)合CEA、CA19-9診斷胃癌的敏感度提高到32.7%。由此認(rèn)為，外周血甲基化SEPT9檢測可能是胃癌篩查的有效手段。

3.3 頭頸磷狀細(xì)胞癌

研究顯示頭頸磷狀細(xì)胞癌組織中25%的RNA表達下降，甲基化SEPT9陽性率為56%，提示甲基化SEPT9可能有腫瘤抑制功能［32］。另一項研究中，頭頸磷狀細(xì)胞癌組織甲基化SEPT9的陽性率為63%，可能與放療、香煙或酒精暴露相關(guān)［33］。Schr?ck 等［34］研究則顯示，外周血甲基化SEPT9診斷頭頸部鱗癌的敏感度為59%，特異度為96%，甲基化SEPT9初始水平升高不僅與T分期、N分期、血管和淋巴浸潤以及腫瘤分級相關(guān)，還與局部復(fù)發(fā)、遠處轉(zhuǎn)移、總生存以及高死亡率相關(guān)，而檢測外周血甲基化SEPT9可使47%的患者較臨床發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移平均提前377 d。提示外周血甲基化SEPT9檢測可能是頭頸磷狀細(xì)胞癌有效的分期、風(fēng)險分層和疾病監(jiān)測方法，患者初診如存在甲基化SEPT9高水平，應(yīng)加強治療后的監(jiān)測及隨訪。

3.4 肝癌

Oussalah等［35］納入了289例肝硬化患者和98例肝癌患者，檢測其外周血甲基化SEPT9情況，發(fā)現(xiàn)外周血甲基化SEPT9的肝癌診斷率較高，進一步行多因素分析顯示，外周血甲基化SEPT9是診斷肝癌的影響因素，認(rèn)為其可作為肝硬化患者篩查肝癌有前景的指標(biāo)，但仍需進一步評估。法國學(xué)者一項臨床試驗（SEPT9-CROSS）正在進行中，該研究擬通過檢測440例肝硬化患者的外周血甲基化SEPT9情況，評價其診斷價值，有關(guān)方面值得期待。

3.5 其他惡性腫瘤

Powrózek 等［36］檢測了 70 例肺癌患者和 100 名健康對照者的外周血甲基化SEPT9情況，發(fā)現(xiàn)31例來自ⅡA、ⅡB、Ⅲ、Ⅳ期的肺癌患者外周血甲基化SEPT9檢測結(jié)果呈陽性，而健康對照組只有4名呈陽性。亞組分析顯示鱗狀細(xì)胞癌較腺癌的陽性率更高（60%vs 26%）。但該研究樣本量有限，因此外周血甲基化SEPT9檢測應(yīng)用于早期診斷肺癌的可行性仍需擴大樣本量進一步驗證。Branchi等［37］研究20例膽管細(xì)胞癌患者，外周血甲基化SEPT9診斷的敏感度為25%，特異度為99%。進一步檢測膽管細(xì)胞癌組織的甲基化SEPT9亦得出類似結(jié)果，其診斷敏感度、特異度分別為29%、100%。因此認(rèn)為，甲基化SEPT9作為診斷膽管細(xì)胞癌標(biāo)志物的臨床作用有限。而在食管癌組織［38］、非肌肉浸潤膀胱癌患者［39］尿液中亦存在甲基化SEPT9，對其檢測在診斷及預(yù)后監(jiān)測中有一定價值，但外周血甲基化SEPT9檢測在其中的應(yīng)用價值有待考證。

4 小結(jié)

目前的研究已證實外周血甲基化SEPT9檢測在結(jié)直腸癌篩查和診斷中的作用。相對于傳統(tǒng)的FOBT、FIT、結(jié)腸鏡檢等篩查方法，其具有無創(chuàng)傷性、方便、安全、敏感度和特異度較高、依從性較好等特點，有望成為結(jié)直腸癌篩查的重要方法。但外周血甲基化SEPT9的檢測技術(shù)、篩查成本以及檢測準(zhǔn)確性等尚待進一步改善，未來可考慮結(jié)合甲基化DNA在人體生物鐘的變化，進一步優(yōu)化升級外周血檢測技術(shù)，促進其檢測更簡易、自動化。今后進一步探索其在惡性腫瘤尤其是結(jié)直腸癌、肝癌等療效評估、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移監(jiān)測、預(yù)后評估等方面的作用和意義值得期待。