焦 娟，宋艷艷，劉 霞，劉 倩，馮志寅，蘇麗萍，何鼎盛，張 巍

乳腺癌是女性最常見惡性腫瘤，其病死率為14%。2006年Bryan等[1]首次提出三陰型乳腺癌的概念，將ER、PR及HER-2均為陰性的乳腺癌定義為三陰型乳腺癌。該亞型乳腺癌對(duì)化療有較高敏感性，但是腫瘤侵襲能力強(qiáng)、進(jìn)展快，缺乏內(nèi)分泌治療和靶向治療，治療效果與其他亞型相比療效較差。目前，乳腺癌治療失敗的主要原因是淋巴道轉(zhuǎn)移和血行轉(zhuǎn)移，因此深入分析三陰型乳腺癌浸潤和轉(zhuǎn)移的機(jī)制，并從中尋找有效的標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，對(duì)改善三陰型乳腺癌患者的治療效果和預(yù)后有重要意義。

近年趨化因子在多種腫瘤中的研究均涉及腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移。CXCL12又稱基質(zhì)細(xì)胞衍生因子SDF-1，是趨化因子家族中的一員，CXCL12主要與其相應(yīng)的受體CXCR4結(jié)合誘導(dǎo)腫瘤的轉(zhuǎn)移進(jìn)程。MMP-2是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移的重要因子，多項(xiàng)研究證實(shí)MMP-2在乳腺癌中存在基因拷貝數(shù)的增加。有文獻(xiàn)報(bào)道[2]在前列腺癌中CXCL12/CXCR4可能通過活化MMP-2的表達(dá)促進(jìn)腫瘤的浸潤，但有關(guān) CXCL12/CXCR4和MMP-2在三陰型乳腺癌浸潤轉(zhuǎn)移中的作用報(bào)道較少。本文以人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株為分析對(duì)象，分別轉(zhuǎn)染CXCR4-siRNA和pcDNA3.1-CXCR4，干擾 CXCR4的表達(dá)，并檢測(cè)轉(zhuǎn)染后腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力，探討CXCL12/CXCR4及MMP-2對(duì) MDA-MB-231 細(xì)胞株增殖、遷移等生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系及主要試劑細(xì)胞系及主要試劑包括人三陰型乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株細(xì)胞(由新疆醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)研究院細(xì)胞庫提供)，Trizol (Invitrogen公司，美國)，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，0.25%胰酶，胎牛血清(Gibco公司，美國)，青霉素-鏈霉素雙抗(Hyclone公司，美國)，OptiMEM(Invitrogen公司，美國)，凋亡試劑盒(BD公司，美國)，Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒、Negative RNAi(Life technologies公司，美國)，β-actin(Abcam公司，美國)，SYBR Select Master Mix(ABI)，pcDNA3.1(上海歐易公司，中國)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)將凍存于液氮中的MDA-MB-231細(xì)胞迅速取出，置于37 ℃水浴鍋使其融化。融化后取出凍存管，用乙醇消毒后開啟，用移液器將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，輕輕顛倒混勻數(shù)次。以1 000 r/min離心5 min，棄上清。加入1 mL含10%新生胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞液接種于干凈的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)基，于37 ℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度>70%時(shí)，用胰酶按照常規(guī)方法進(jìn)行傳代。取對(duì)數(shù)成長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前1天，將處于對(duì)數(shù)期生長的MDA-MB-231細(xì)胞用胰蛋白酶進(jìn)行消化，計(jì)數(shù)后稀釋成所需的密度，接種到相應(yīng)的板孔中(保證在轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度約70%)，于37 ℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)過夜，陰性對(duì)照用Oligofectamine轉(zhuǎn)染試劑按照Lipofectamine 3000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為3組：實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染CXCR4-siRNA和pcDNA3.1-CXCR4)、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照品)和空白對(duì)照組(未做轉(zhuǎn)染處理)。

1.4Westernblot實(shí)驗(yàn)取細(xì)胞≥1×106個(gè)，加入500 μL RIPA裂解液，充分混勻。冰上放置30 min， 4 ℃，12 000 r/min離心15 min，收集上清，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白經(jīng)凝膠進(jìn)行電泳分離后，穩(wěn)壓冰浴電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗孵育4 ℃過夜，二抗孵育后，AP法顯色，化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)、拍照，與內(nèi)參β-actin比較，計(jì)算目的蛋白的表達(dá)豐度。

1.5RT-PCR實(shí)驗(yàn)分別取2 μg總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以獲得的cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔。引物序列如下：CXCR4上游引物：5′-GGCCCTAGCTTTCTTCCACT-3′，下游引物：5′-GAGAGGATCTTGAGGCTGGA-3′；CXCL12上游引物：5′-GGCTCCCTGTAACCTCTTCAG-3′，下游引物：5′-CAGACTCAATCCCAACACACA-3′；MMP-2上游引物：5′-GATACCCCTTTGACGGTAAGGA-3′，下游引物：5′-CCTTCTCCCAAGGTCCATAGC-3′；β-actin上游引物：5′-ATGATGATATCGCCGCGCTC-3′，下游引物：5′-TCGATGGGGTACTTCAGGG-3′。利用SYBR Green染料檢測(cè)細(xì)胞目的基因的表達(dá)，并將β-actin作為內(nèi)參。總反應(yīng)體積為20 μL，反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min,95 ℃ 2 min 預(yù)變性后，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s合計(jì)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。采用相對(duì)定量公式：2-△△Ct，計(jì)算細(xì)胞目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6劃痕實(shí)驗(yàn)鋪板細(xì)胞培養(yǎng)12 h，使用不含胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，并在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h，進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)并用DMEM完全培養(yǎng)基換液。分別在劃痕培養(yǎng)0、24、48、72 h進(jìn)行拍照，計(jì)算劃痕之間細(xì)胞愈合的距離。

1.7MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前一天用胰酶消化收集細(xì)胞，接種于96孔板，轉(zhuǎn)染步驟同前，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，避光震蕩8～10 min，選擇490 nm波長，在酶標(biāo)儀上測(cè)定待測(cè)樣孔光吸收值，記錄結(jié)果并繪制生長曲線。

2 結(jié)果

2.1Westernblot法檢測(cè)分別轉(zhuǎn)染CXCR4-siRNA和pcDNA3.1-CXCR4后CXCR4、CXCL12及MMP-2蛋白的變化體外通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CXCR4-siRNA和pcDNA3.1-CXCR4，在轉(zhuǎn)染72 h后收集細(xì)胞，經(jīng)Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，CXCR4蛋白條帶在4.3×104處顯色，CXCL12蛋白在1.1×104處顯色，MMP-2蛋白條帶在7.2×104處顯色，內(nèi)參β-actin蛋白條帶在4.2×104處顯色(圖1)。分析各條帶的灰度值，以β-actin蛋白為內(nèi)參，對(duì)CXCR4、CXCL12及MMP-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染CXCR4-siRNA，CXCR4蛋白的表達(dá)量顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.01)，CXCL12蛋白表達(dá)量顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.01)，MMP-2蛋白的表達(dá)量顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.01)；轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CXCR4后CXCR4蛋白的表達(dá)量顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.01)，CXCL12蛋白的表達(dá)量顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.01)，MMP-2蛋白表達(dá)量顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.01)。

2.2RT-PCR檢測(cè)分別轉(zhuǎn)染CXCR4-siRNA和pcDNA3.1-CXCR4后CXCR4、CXCL12及MMP-2mRNA的變化體外通過脂質(zhì)體介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CXCR4-siRNA和pcDNA3.1-CXCR4，在轉(zhuǎn)染72 h后收集細(xì)胞，提取各組細(xì)胞中的總RNA。經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，并通過2-△△Ct計(jì)算目的基因CXCR4、CXCL12及MMP-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染CXCR4-siRNA后CXCR4的mRNA表達(dá)量顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.01)，CXCL12的mRNA表達(dá)量顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.01)，MMP-2的mRNA表達(dá)量顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.01)；轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CXCR4后CXCR4的mRNA表達(dá)量顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.01)，CXCL12的mRNA表達(dá)量顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.01)，MMP-2的mRNA表達(dá)量顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.01，圖2～4)。

圖1 Western blot檢測(cè)CXCR4-siRNA(A)和 pcDNA3.1-CXCR4(B)轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后CXCR4、CXCL12及MMP-2蛋白的表達(dá)

2.3劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分別轉(zhuǎn)染CXCR4-siRNA和pcDNA3.1-CXCR4后MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的變化沿6孔板的直徑均勻用力劃痕后，轉(zhuǎn)染CXCR4-siRNA和pcDNA3.1-CXCR4，檢測(cè)干擾CXCR4基因的表達(dá)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響。從倒置顯微鏡中細(xì)胞劃痕的圖像可見，在轉(zhuǎn)染CXCR4-siRNA 72 h后與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞間距寬于對(duì)照組，愈合距離比大于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示轉(zhuǎn)染CXCR4-siRNA后細(xì)胞的遷移能力下降，劃痕愈合遲緩，下調(diào)CXCR4基因的表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的遷移；在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CXCR4 72 h后與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞間距窄于對(duì)照組，愈合距離比小于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖5)，提示轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CXCR4后細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)，劃痕愈合加快，上調(diào)CXCR4基因的表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移。

圖2 RT-PCR檢測(cè)各組MDA-MB-231細(xì)胞中CXCR4 mRNA水平表達(dá)

A.轉(zhuǎn)染CXCR4-siRNA組；B.轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CXCR4組；**P<0.01

圖3 RT-PCR檢測(cè)各組MDA-MB-231細(xì)胞中CXCL12 mRNA水平表達(dá)

A.轉(zhuǎn)染CXCR4-siRNA組；B.轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CXCR4組；**P<0.01

圖4 RT-PCR檢測(cè)各組MDA-MB-231細(xì)胞中MMP-2 mRNA水平表

A.轉(zhuǎn)染CXCR4-siRNA組；B.轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CXCR4組；**P<0.01

圖5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CXCR4-siRNA和pcDNA3.1-CXCR4轉(zhuǎn)染MDA-MB-231后細(xì)胞遷移能力變化

2.4MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分別轉(zhuǎn)染CXCR4-siRNA和pcDNA3.1-CXCR4后MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力的變化應(yīng)用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果顯示：CXCR4-siRNA 轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞48、72、96 h后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組降低，其中以72 h降低最為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示下調(diào)CXCR4的表達(dá)能夠顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖能力。pcDNA3.1-CXCR4轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞48 、72、96 h后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比顯著增加，其中以72 h降低最為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖6)。提示下調(diào)CXCR4的表達(dá)能夠顯著促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞的增殖能力。

圖6 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染CXCR4-siRNA和pcDNA3.1-CXCR4后細(xì)胞增殖能力的變化

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，WHO(2014)乳腺腫瘤分類的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示乳腺癌占女性腫瘤的16%，每年約50萬以上的患者死亡。其中三陰型乳腺癌占浸潤性乳腺癌的15%～20%，具有侵襲性強(qiáng)、病理分級(jí)高和廣泛的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且在年輕患者中更為常見[3]。與其他亞型的乳腺癌相比，三陰型乳腺癌患者在治療2～3年后發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和早期復(fù)發(fā)的可能性較高，患者的生存率更低。因此，立足分子水平深入分析三陰型乳腺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移機(jī)制有重要的臨床意義。

CXCL12是趨化因子CXC亞家族成員，并在肺、肝、骨髓和淋巴結(jié)等組織中廣泛表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)CXCL12與其受體CXCR4結(jié)合在造血過程中發(fā)揮重要作用，即調(diào)控骨髓造血干細(xì)胞的歸巢和驅(qū)使淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)至炎癥部位[4]。CXCR4是存在于細(xì)胞表面的7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體，在正常狀態(tài)下CXCR4多表達(dá)于白細(xì)胞、內(nèi)皮和上皮細(xì)胞的表面。在腫瘤中CXCR4參與多種實(shí)體腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移，如乳腺癌[5]、腎透明細(xì)胞癌[6]、結(jié)直腸腫瘤[7]、卵巢透明細(xì)胞癌[8]和子宮頸鱗癌[9]等，并與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)。有研究報(bào)道在局灶晚期乳腺癌中CXCR4過表達(dá)組腫瘤復(fù)發(fā)的相對(duì)危險(xiǎn)度和腫瘤死亡的相關(guān)危險(xiǎn)度均顯著高于CXCR4低表達(dá)組[10]。Holm等[11]在103例乳腺癌樣本中證實(shí)存在CXCR4過表達(dá)，并與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER/PR及HER-2的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但CXCR4高表達(dá)且HER-2陰性的乳腺癌侵襲性更強(qiáng)且更易復(fù)發(fā)，CXCR4可作為評(píng)估HER-2陰性乳腺癌的侵襲性生物學(xué)行為指標(biāo)。Wu等[5]研究結(jié)果顯示CXCR4在乳腺癌中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，而CXCL12在兩者之間的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CXCL12在原發(fā)性乳腺癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌中表達(dá)存在差異。有研究報(bào)道[12]在151例三陰型乳腺癌中有近75%的病例存在CXCR4高表達(dá)，CXCR4高表達(dá)組患者腫瘤復(fù)發(fā)和發(fā)生癌癥相關(guān)死亡原因的概率是CXCR4低表達(dá)組的6倍。

本實(shí)驗(yàn)選用人三陰型乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231作為分析對(duì)象，通過體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)分別轉(zhuǎn)染CXCR4-siRNA和pcDNA3.1-CXCR4，干擾CXCR4的表達(dá)，并通過Western blot和RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果，結(jié)果顯示CXCR4在蛋白水平和mRNA水平的表達(dá)均發(fā)生相應(yīng)改變，證實(shí)轉(zhuǎn)染有效。繼而從細(xì)胞增殖、遷移運(yùn)動(dòng)能力以及MMP-2表達(dá)變化等方面探討CXCL12/CXCR4信號(hào)通路與MMP-2的關(guān)系，以期為三陰型乳腺癌浸潤轉(zhuǎn)移的阻斷治療提供理論基礎(chǔ)。

CXCR4除誘導(dǎo)白細(xì)胞的遷移，還是B淋巴細(xì)胞生成和骨髓生成所必需的誘導(dǎo)因子，CXCR4通過與CXCL12相互作用，誘導(dǎo)造血干細(xì)胞細(xì)胞骨架的重排，增加細(xì)胞之間的黏附，誘導(dǎo)它們遷移至特定的器官，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，直接或以旁分泌的方式促進(jìn)血管生成，最終形成轉(zhuǎn)移性腫瘤[13]。間質(zhì)的成纖維細(xì)胞構(gòu)成乳腺癌細(xì)胞微環(huán)境的主要部分，研究報(bào)道腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(并非正常的乳腺成纖維細(xì)胞)中CXCL12呈高表達(dá)[14]，CXCL12的表達(dá)通過直接增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞生長和通過招募腫瘤血管生成所需的內(nèi)皮祖細(xì)胞，促進(jìn)乳腺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移。

本組在MTT實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，下調(diào)CXCR4表達(dá)，乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖和遷移能力受到明顯抑制；而上調(diào)CXCR4表達(dá)，乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖和遷移能力明顯增強(qiáng)，表明腫瘤中CXCR4表達(dá)的增加會(huì)刺激腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲性，并可能與間質(zhì)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞中的CXCL12共同作用，改變腫瘤的微環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移。

細(xì)胞外基質(zhì)的降解在腫瘤的浸潤和侵襲過程中起重要作用，其中細(xì)胞外基質(zhì)的降解主要依靠蛋白水解酶，MMP是蛋白水解酶中較為重要的一類，MMP-2是最主要的降解細(xì)胞外基質(zhì)的水解酶。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染CXCR4-siRNA后MMP-2的表達(dá)降低，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CXCR4后MMP-2表達(dá)上調(diào)，提示三陰型乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中CXCR4誘導(dǎo)MMP-2的活化，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移。這與CXCR4/MMP-2在前列腺癌[2]、肺癌和甲狀腺癌[15-16]浸潤轉(zhuǎn)移中的研究結(jié)果一致，但具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步分析。

綜上所述，在三陰型乳腺癌中存在CXCL12/CXCR4/MMP-2信號(hào)通路的激活，下調(diào)CXCR4可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，還需深入探討三陰型乳腺癌浸潤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。

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