鄭細閏，劉 影，張志發(fā)，李楚天，何青蓮，鄭廣娟

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)在甲狀腺癌中發(fā)生率最高，約占85%[1]。PTC術(shù)后10年生存率可達90%以上，其預(yù)后雖良好，但尚有少部分PTC患者因腫瘤具有較強的侵襲性而不易完整切除，從而導(dǎo)致病情遷延或疾病復(fù)發(fā)[2]，因此預(yù)后判斷與合理的干預(yù)措施對PTC的治療有重要意義。研究表明，B-raf基因V600E突變與PTC的臨床病理特征相關(guān)[3]，且近年針對B-raf基因V600E突變的分子靶向藥物(如Vemurafenib)備受關(guān)注[4]，B-raf基因V600E突變在PTC患者中發(fā)生率為28%～83%[5]。因此，對PTC患者行B-raf基因V600E突變檢測具有較好的臨床指導(dǎo)意義。本文現(xiàn)從操作流程、檢測結(jié)果等方面對術(shù)中冷凍病理組織和石蠟包埋組織兩種來源的DNA提取方法進行比較，以確定臨床B-raf基因V600E突變更快捷、更準確的檢測方法，為PTC患者提供更優(yōu)質(zhì)的服務(wù)。

1 材料與方法

1.1材料選取2016年4～6月廣東省中醫(yī)院病理科大學(xué)城醫(yī)院術(shù)中冷凍病理診斷為PTC的20例患者作為分析對象，分別于術(shù)中取其冷凍切片10張(切片5 μm厚)和術(shù)后第2天取同一病理號的石蠟包埋組織切片10張(切片5 μm厚)，同時對冷凍和石蠟切片進行HE染色，劃取腫瘤細胞富集區(qū)域，并進行腫瘤細胞DNA提取。

1.2儀器試劑全自動冷凍切片機、超微量分光光度計ND-8000、全自動組織脫水機(Thermo Scientific公司)；石蠟包埋組織切片機(Leica公司)；全自動染色機(Leica公司)；DNA提取試劑盒(寶創(chuàng)生物公司)；生物安全柜(阿爾泰實驗室設(shè)備公司)；超凈工作臺(蘇潔凈化設(shè)備公司)；人類B-raf基因V600E突變檢測試劑盒(武漢海吉力公司)；RT-PCR檢測儀(ABI公司)；水平電泳儀(Bio-Rad公司)；凝膠成像系統(tǒng)(Cambridge公司)。

1.3DNA提取為了防止交叉污染，每一個冷凍病理組織和石蠟包埋組織在實驗過程中均嚴格控制提取條件。切片時確保每塊組織使用新的刀片，周圍沒有其他組織的廢屑，將切片貼于未使用過的載玻片上；固定和脫蠟時，確保對每一個組織單獨進行固定和脫蠟，固定液和脫蠟液不重復(fù)、不交叉使用；PCR實驗室分為試劑準備區(qū)、標本制備區(qū)、PCR擴增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)，DNA的提取在生物安全柜內(nèi)進行，使用一次性已滅菌無核酸酶的潔凈吸頭；PCR加樣在超凈工作臺內(nèi)進行，操作整個過程確保每個標本標記準確，無交叉混淆現(xiàn)象。

1.3.1冷凍病理組織DNA提取 將冷凍切片放置于95%乙醇固定液中固定10 min，再置蒸餾水中5 min復(fù)水，轉(zhuǎn)移至裝超純水的小燒杯，采用Biotron DNA提取試劑盒進行提取，具體操作步驟如下：根據(jù)術(shù)中冷凍HE切片染色結(jié)果，將腫瘤細胞富集區(qū)域刮取下來，放于裝有200 μL ATL的1.5 mL EP管中，然后加入20 μL蛋白酶混合液，吹打混勻；于56 ℃水浴1～3 h或直至組織被消化完全(也可消化過夜)；取出向離心管中加入200 μL變性液AL和200 μL無水乙醇，渦旋混勻后短暫離心；將吸附柱裝在收集管中，轉(zhuǎn)移混合液至吸附柱，10 000g離心1 min；倒棄濾液，把柱子裝回收集管中，加入500 μL洗滌液GW1至吸附柱中，10 000g離心1 min；倒棄濾液，把柱子裝回收集管中，加入650 μL洗滌液GW2至吸附柱中，10 000g離心1 min；倒棄濾液，把柱子裝回收集管中，10 000g離心空柱3 min；將吸附柱轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP管中，加入65 μL洗脫液EB至吸附柱的膜中央，靜置1 min，10 000g離心1 min；丟棄DNA吸附柱，應(yīng)用ND-8000超微量分光光度計對提取的DNA進行濃度及質(zhì)量測定，其符合標準為1.7< OD260/OD280<2.1，濃度超過100 ng/μL的標本須將濃度稀釋到100 ng/μL保存。

1.3.2石蠟包埋組織DNA提取 將石蠟切片按照標準操作規(guī)程進行脫蠟，具體過程：二甲苯Ⅰ 10 min、二甲苯Ⅱ 10 min、無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、95%乙醇 5 min、80%乙醇 5 min、70%乙醇5 min、蒸餾水5 min，合計約1 h。采用Biotron DNA提取試劑盒進行提取，具體操作步驟基本與冷凍切片DNA提取法相同，另需將56 ℃水浴后的標本置于90 ℃繼續(xù)水浴1 h。

1.4DNA質(zhì)量鑒定將冷凍病理組織和石蠟包埋組織提取的DNA分別進行質(zhì)量鑒定，另取血液提取同樣濃度DNA標本1例作為陽性對照，DNA洗脫液EB作為陰性對照。分別取5 μL基因組DNA與1 μL 6×Loading Buffer混勻，在1.0%的瓊脂糖凝膠孔中進行點樣，同時加5 μL Marker進行標記，電泳條件為80 V 60 min。最后在紫外凝膠成像系統(tǒng)下分析電泳結(jié)果。

1.5RT-PCR檢測B-raf基因V600E突變采用武漢海吉力公司的人類B-raf基因V600E突變檢測試劑盒進行RT-PCR檢測，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。每孔DNA上樣量為6 ng，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min，1個循環(huán)；95 ℃ 20 s，62 ℃ 20 s，合計15個循環(huán)；95 ℃ 20 s，60 ℃ 40 s，合計31個循環(huán)；60 ℃時收集突變信號FAM和內(nèi)參信號VIC。V600E突變陽性結(jié)果判讀標準：FAM信號CT值為11～26，且ΔCT值≤6。

2 結(jié)果

2.1兩種方法提取的基因組DNA質(zhì)量對比瓊脂糖凝膠電泳圖顯示，20例石蠟包埋組織提取的基因組DNA均較冷凍病理組織提取的DNA降解嚴重，質(zhì)量相對較差(圖1)。兩種方法所得DNA的A260/A280值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表1)。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳圖

A.20例石蠟包埋組織DNA；B.20例術(shù)中冷凍病理組織DNA；陰性對照為Elute Buffer，陽性對照為血液gDNA

表1 兩種方法提取DNA A260/A280值比較

2.2兩種方法RT-PCR檢測比較20例標本B-raf基因V600E突變檢測結(jié)果完全一致，其中檢測陽性共突變15例，比較15例陽性標本的FAM、VIC信號的CT值和兩者的ΔCT值，可以發(fā)現(xiàn)冷凍病理組織的FAM和VIC信號的CT值均小于石蠟包埋組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩種方法所得陽性結(jié)果的ΔCT值，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表2)。

表2 兩種方法RT-PCR檢測結(jié)果對比

與石蠟包埋組織相比，*P<0.05

3 討論

在科技發(fā)展技術(shù)日益革新的今天，速度是醫(yī)學(xué)技術(shù)提升的主要切入點。從石蠟包埋組織中提取DNA是目前臨床研究常用手段，其操作簡便，實用性強，但是石蠟組織中提取的DNA降解嚴重[6]，這對臨床即時檢測提出新的思考。本實驗提出術(shù)中冷凍病理組織提取DNA的操作方法，實驗證明術(shù)中冷凍病理組織提取DNA可在發(fā)布冷凍報告后2 h內(nèi)得到DNA，3.5 h內(nèi)檢測完畢并完成臨床報告，而石蠟包埋組織還需等到第2個工作日將蠟塊包埋好再進行脫蠟、提取，常規(guī)脫蠟需1 h且提取過程中需進行90 ℃水浴解除福爾馬林固定導(dǎo)致的DNA與蛋白質(zhì)產(chǎn)生的交聯(lián)，耗費時間長。

此外，凝膠電泳和RT-PCR檢測內(nèi)參信號VIC值的結(jié)果均顯示，與石蠟包埋組織DNA相比，術(shù)中冷凍病理組織提取的DNA完整性更好，質(zhì)量更高。本實驗結(jié)果顯示：從術(shù)中冷凍病理組織中提取DNA可顯著縮短臨床檢測B-raf基因V600E突變的時間，且DNA質(zhì)量更優(yōu)，因此使用該方法可以更快捷、更準確的為臨床服務(wù)。

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