周 萍，王 莉，黃一凡，侯 俊，湯 梅，王 瓊

Axl蛋白屬于跨膜酪氨酸激酶受體蛋白，其基因最早在慢性粒細(xì)胞白血病患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，該受體包含1個(gè)胞內(nèi)(C末端)激酶結(jié)構(gòu)域和1個(gè)獨(dú)特的胞外(N末端)結(jié)構(gòu)域，前者包含3個(gè)自磷酸化位點(diǎn)(Tyr779、Tyr821、Tyr886)，后者由2個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域和2個(gè)重復(fù)纖維連接蛋白Ⅲ組成，類(lèi)似于神經(jīng)細(xì)胞黏附分子結(jié)構(gòu)[1-2]。Axl蛋白的過(guò)表達(dá)能促進(jìn)腫瘤形成和演進(jìn)，包括腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞存活、血管生成、對(duì)化療和靶向治療藥物耐藥、細(xì)胞轉(zhuǎn)化及細(xì)胞增殖等均有促進(jìn)作用[3-4]。已有文獻(xiàn)報(bào)道[5]Axl蛋白在甲狀腺、食管、胃、肺、肝臟、乳腺等多種腫瘤組織中高表達(dá)，并認(rèn)為其是有效的靶向治療基因位點(diǎn)[6]。本文通過(guò)檢測(cè)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中Axl蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步明確其與臨床病理特征的相關(guān)性，為靶向治療提供參考。

1 材料與方法

1.1材料收集川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2012年1月～2013年6月存檔的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(invasive ductal carcinoma, IDC)石蠟樣本151例，排除術(shù)前進(jìn)行新輔助治療的病例，從中篩選有完整臨床資料和隨訪資料的70例IDC，由兩位有經(jīng)驗(yàn)的乳腺病理醫(yī)師根據(jù)WHO(2012)乳腺腫瘤分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所有納入病例共同閱片，并進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)。70例患者中位年齡47.5歲，平均49.9歲(35～68歲)，其中左側(cè)乳腺31例(44.3%)，右側(cè)乳腺39例(55.7%)。48例(68.6%)患者伴同側(cè)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)目1～31枚不等，1例患者伴骨轉(zhuǎn)移，1例肺轉(zhuǎn)移。Nottingham組織學(xué)分級(jí)：Ⅰ級(jí)5例(7.1%)，Ⅱ級(jí)41例(58.6%)，Ⅲ級(jí)24例(34.3%)。腫瘤臨床分期：1期6例(8.6%)，2期39例(55.7%)，3期23例(32.9%)，4期2例(2.9%)。70例患者隨訪時(shí)間10～52個(gè)月，其中61例(87.1%)存活，9例死于該病(12.9%)。

1.2方法

1.2.1免疫組化 采用免疫組化EnVision兩步法進(jìn)行染色[7]，除Axl抗體購(gòu)自Abclonal公司外，其余抗體及試劑均購(gòu)自北京中杉金橋公司。Axl為兔多克隆抗體，ER、PR、HER-2、Ki-67為兔單克隆抗體，CK5/6為鼠單克隆抗體。定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)的抗體，采用枸櫞酸水浴修復(fù)組織；定位于細(xì)胞核的抗體，采用EDTA水浴修復(fù)組織。Axl抗體以試劑公司提供的陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照；ER、PR、CK5/6以乳腺內(nèi)正常乳腺組織為陽(yáng)性對(duì)照；HER-2以IDC中的3+病例作陽(yáng)性對(duì)照；Ki-67以淋巴結(jié)生發(fā)中心為陽(yáng)性對(duì)照；所有病例均以PBS代替一抗作為空白對(duì)照。

1.2.2熒光原位雜交 所有免疫組化染色評(píng)估為HER-2(2+)的病例，均進(jìn)行熒光原位雜交檢測(cè)。HER-2雙色熒光探針購(gòu)自廣州安必平公司。石蠟組織4 μm厚切片，依次經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，滅菌純水洗滌后煮沸20 min，胃蛋白酶消化5～15 min后梯度乙醇脫水，雜交儀中85 ℃變性5 min，37 ℃雜交10～18 h，雜交完成后洗滌，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，封固觀察。以組織中≥75%的細(xì)胞核顯示雙色信號(hào)時(shí)視為雜交成功。

1.3結(jié)果判定HER-2蛋白表達(dá)結(jié)果由兩位有經(jīng)驗(yàn)的乳腺病理醫(yī)師，根據(jù)2013年美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)/美國(guó)病理學(xué)家學(xué)會(huì)(ASCO/CAP)推薦的HER-2檢測(cè)指南標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀[8]：腫瘤細(xì)胞無(wú)包膜著色或≤10%的腫瘤細(xì)胞膜不完整的微弱陽(yáng)性為0；>10%的腫瘤細(xì)胞膜不完整的微弱陽(yáng)性為1+；>10%的腫瘤細(xì)胞膜不完整的弱到中等強(qiáng)度陽(yáng)性或≤10%的腫瘤細(xì)胞膜完整的強(qiáng)陽(yáng)性為2+；>10%的腫瘤細(xì)胞膜完整的強(qiáng)陽(yáng)性為3+。熒光原位雜交檢測(cè)結(jié)果由具有分子檢測(cè)資質(zhì)的病理醫(yī)師根據(jù)2013年ASCO/CAP推薦的HER-2檢測(cè)指南標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀[8]，連續(xù)計(jì)數(shù)40個(gè)浸潤(rùn)癌細(xì)胞，HER-2/CEP17比值≥2.0，或HER-2/CEP17比值<2.0，但平均HER-2拷貝數(shù)/細(xì)胞≥6.0均為HER-2陽(yáng)性；HER-2/CEP17比值<2.0，且平均HER-2拷貝數(shù)/細(xì)胞<4.0為HER-2陰性；HER-2/CEP17比值<2.0，平均HER-2拷貝數(shù)/細(xì)胞≥4.0，但<6.0為HER-2原位雜交不確定。Axl蛋白陽(yáng)性定位于細(xì)胞膜，根據(jù)腫瘤細(xì)胞膜著色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)著色為0分，弱著色為1分，中等強(qiáng)度為2分，強(qiáng)著色為3分；根據(jù)腫瘤陽(yáng)性細(xì)胞所占比例計(jì)分：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分；將著色強(qiáng)度與陽(yáng)性百分比評(píng)分相加得到腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性評(píng)分，≥4分即為高表達(dá)[9]。ER、PR、Ki-67蛋白以細(xì)胞核棕褐色著色為陽(yáng)性，根據(jù)Allred評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[10]對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行判讀：Allred評(píng)分總分為百分比評(píng)分與強(qiáng)度評(píng)分總和，總分≤2分為陰性，≥3分為陽(yáng)性。按陽(yáng)性百分比評(píng)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，<1/100為1分，>1/100且<1/10為2分，≥1/10且<1/3為3分，≥1/3且<2/3為4分，≥2/3為5分；按陽(yáng)性強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)著色為0分，弱陽(yáng)性為1分，中等陽(yáng)性為2分， 強(qiáng)陽(yáng)性為3分。腫瘤分子分型采用2015年St.Gallen國(guó)際專(zhuān)家共識(shí)推薦的乳腺癌分子分型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類(lèi)[11]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Axl蛋白在不同分子亞型組、不同組織學(xué)級(jí)別及不同臨床分期的表達(dá)差異采用方差分析，Axl蛋白與臨床病理特征的相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，生存分析采用Kaplan-Meier檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果

2.1腫瘤分子分型70例乳腺I(mǎi)DC免疫組化標(biāo)記顯示：51例(72.9%)ER(+)，40例(57.1%)PR(+)，4例(5.8%)CK5/6(+)，19例(27.1%)HER-2(+)，其中11例(15.7%)為HER-2(3+)，8例為HER-2(2+)，經(jīng)熒光原位雜交證實(shí)為擴(kuò)增病例。根據(jù)2015年St.Gallen國(guó)際專(zhuān)家共識(shí)推薦的乳腺癌分子分型標(biāo)準(zhǔn)[12]，管腔A型8例(11.4%)；管腔B型，HER-2(-)37例(52.9%)；管腔B型，HER-2(+)7例(10.0%)；HER-2亞型12例(17.1%)；三陰型6例(8.6%)，其中基底亞型4例(5.8%)。

2.2Axl蛋白表達(dá)與乳腺I(mǎi)DC臨床病理特征的關(guān)系70例患者的腫瘤細(xì)胞膜均不同程度表達(dá)Axl蛋白，其中29例(41.4%)為高表達(dá)(≥4分)，41例(58.6%)呈低至中等表達(dá)(<4分)，且在浸潤(rùn)癌中的表達(dá)高于浸潤(rùn)灶旁的導(dǎo)管內(nèi)癌(ductal carcinoma in situ, DCIS)，高級(jí)別浸潤(rùn)癌中的表達(dá)高于低級(jí)別浸潤(rùn)癌(圖1)。Axl蛋白表達(dá)在不同組織學(xué)級(jí)別(P<0.001)和不同分期(P=0.005)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在不同分子分型間的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.273)。采用相關(guān)性分析進(jìn)一步提示Axl蛋白的表達(dá)與腫瘤級(jí)別(rs=0.651、P<0.001)、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(rs=0.474、P<0.001)以及轉(zhuǎn)移數(shù)目(rs=0.550、P<0.001)、腫瘤分期(rs=0.355、P=0.003)、Ki-67增殖指數(shù)(rs=0.402、P=0.001)均呈正相關(guān)，與患者年齡(P=0.457)、腫瘤大小(P=0.682)、ER(P=0.416)、PR(P=0.574)、HER-2(P=0.150)狀態(tài)及腫瘤的分子分型(P=0.344)均無(wú)相關(guān)性。

2.3生存分析70例患者中高表達(dá)Axl蛋白的患者總生存率(79.3%)低于中～低表達(dá)組患者(92.7%)(χ2=3.877，P=0.049，圖2A)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目<4的患者總生存率顯著優(yōu)于轉(zhuǎn)移數(shù)目≥4的患者(χ2=4.783，P=0.029，圖2B)，但在淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移兩組間，總生存率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.001，P=0.980)。不同組織學(xué)級(jí)別與不同臨床分期患者的總生存率，在本組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.058，P=0.809；χ2=2.425，P=0.119，圖2C、D)。

3 討論

酪氨酸激酶家族蛋白是一組跨膜蛋白，由受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases, RTKs)和非受體酪氨酸激酶(non-receptor tyrosine kinases, NRTKs)組成，RTKs被認(rèn)為參與腫瘤形成，可作為腫瘤治療的靶點(diǎn)[12]。RTKs中存在受體激酶TAM(包括Tyro-3、Axl、Mer)，其中Axl最初分離自慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞染色體19q13.2和20外顯子[13]，目前已在多種腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)Axl蛋白過(guò)表達(dá)。本組乳腺I(mǎi)DC腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜均有不同程度Axl蛋白表達(dá)，其表達(dá)在浸潤(rùn)性癌高于周邊DCIS，在高級(jí)別浸潤(rùn)性癌中表達(dá)高于低級(jí)別浸潤(rùn)性癌，在不同組織學(xué)級(jí)別的表達(dá)具有差異性，且與腫瘤級(jí)別呈正相關(guān)，提示Axl蛋白的活化具有調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞分化、促進(jìn)腫瘤向高級(jí)別演進(jìn)的作用，但其分子機(jī)制和演進(jìn)過(guò)程尚不完全清楚。文獻(xiàn)報(bào)道Axl與多個(gè)信號(hào)通路相關(guān)，其中PI3K/Akt通路是其主要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路[2]。Axl是TGF-β1下游的效應(yīng)器，可通過(guò)TGF-β1介導(dǎo)其表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)能力，降低細(xì)胞對(duì)化療的敏感性，該調(diào)節(jié)作用部分依賴于PI3K/Akt-PAK1信號(hào)通路[6]。

圖1A.Axl蛋白在DCIS中的表達(dá)，EnVision兩步法；B.Axl蛋白在低級(jí)別IDC中的表達(dá)，EnVision兩步法；C. Axl蛋白在高級(jí)別IDC的表達(dá)，EnVision兩步法；D.Axl蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)，EnVision兩步法

既往體外實(shí)驗(yàn)研究還發(fā)現(xiàn)上調(diào)Axl蛋白的表達(dá)，能促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的遷徙[14-15]和胰腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[16]。本組伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者Axl蛋白表達(dá)高于無(wú)轉(zhuǎn)移者，且其表達(dá)與轉(zhuǎn)移數(shù)目、臨床分期和Ki-67增殖指數(shù)呈正相關(guān)，進(jìn)一步提示Axl蛋白的高表達(dá)是腫瘤轉(zhuǎn)移、演進(jìn)和增殖的重要促進(jìn)因素。文獻(xiàn)報(bào)道Axl蛋白的表達(dá)上調(diào)與乳腺癌患者腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期密切相關(guān)，認(rèn)為Axl作為生長(zhǎng)因子，在促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中起重要作用[6,12]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。Axl蛋白表達(dá)的上調(diào)可能與PI3K/Akt-PAK1信號(hào)分子的蛋白磷酸化水平有關(guān)，但其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步分析[6]。

圖270例浸潤(rùn)性乳腺癌患者不同Axl表達(dá)狀態(tài)(A)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)(B)以及不同組織學(xué)分級(jí)(C)和不同臨床分期(D)的Kaplan-Meier生存曲線

本組患者年齡、腫瘤大小、ER、PR及腫瘤分子分型與Axl蛋白的表達(dá)無(wú)相關(guān)性，文獻(xiàn)報(bào)道ER能促進(jìn)Axl的表達(dá)，兩者的相互作用在乳腺上皮細(xì)胞增殖、分化和凋亡過(guò)程中起重要作用[17]，同時(shí)PRB能使Axl的配體Gas6表達(dá)上調(diào)20倍。另有研究認(rèn)為HER-2可活化Axl，具有重要的臨床意義，但在本組中未發(fā)現(xiàn)ER、PR表達(dá)以及HER-2狀態(tài)與Axl具有明確相關(guān)性，由于本組有完整隨訪資料的病例有限，有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本深入分析。

本組生存分析顯示，Axl蛋白的高表達(dá)預(yù)示患者總生存率下降，是預(yù)后的不良因素，Dunne等[18]在早期結(jié)腸癌患者中發(fā)現(xiàn)Axl水平的上調(diào)提示臨床預(yù)后差，與本組結(jié)果一致。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對(duì)腫瘤患者預(yù)后具有提示作用，本組發(fā)現(xiàn)當(dāng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目<4時(shí)，患者總生存率與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者差異無(wú)顯著性，但當(dāng)轉(zhuǎn)移數(shù)目≥4時(shí)，患者的總生存率顯著下降，提示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)對(duì)乳腺I(mǎi)DC患者預(yù)后的影響并不直接取決于是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而是主要取決于轉(zhuǎn)移數(shù)目，轉(zhuǎn)移數(shù)目≥4提示患者預(yù)后不佳。

Axl蛋白作為跨膜酪氨酸激酶受體蛋白，在乳腺I(mǎi)DC中其高表達(dá)提示具有促進(jìn)腫瘤演進(jìn)的作用，包括向高級(jí)別腫瘤分化、增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等，提示患者預(yù)后不佳，對(duì)患者預(yù)后評(píng)估具有一定指導(dǎo)作用。目前，本實(shí)驗(yàn)在蛋白水平對(duì)Axl進(jìn)行初探，在后續(xù)工作中將擴(kuò)大樣本量，并從分子水平進(jìn)一步分析Axl及其配體在乳腺癌中的作用機(jī)制和對(duì)臨床治療的指導(dǎo)意義。

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