任志敏，古雅麗，李新敏，張 瑤

目前，乳腺癌發(fā)病率居于女性腫瘤的第一位，美國癌癥協(xié)會的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，2016年乳腺癌預(yù)計新發(fā)病例249 260例，死亡40 890例[1-2]。因此，尋找新的乳腺癌靶基因?qū)θ橄侔┑念A(yù)防和治療具有重要意義。隨著靶向治療的發(fā)展，miRNA在乳腺癌中的應(yīng)用已成為研究的熱點[3-4]。miR-3619-5p是近年發(fā)現(xiàn)的具有明顯抑癌效應(yīng)的miRNA[5-6]，在乳腺癌細(xì)胞中作用尚未見報道。本文以體外培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和T47D為實驗對象，觀察miR-3619-5p對乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響及探討可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料has-miR-3619-5p mimic、對照組(轉(zhuǎn)染dsControl)和5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(EdU)細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自廣州銳博公司；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和T47D購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司； Lipofectamine 3000、Opti-MEM購自美國Invitrogen公司；qPCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；PCR引物合成購自上海生工公司；BCA protein assay kit購自美國Pierce公司；一抗鼠單抗GAPDH、兔多抗p21、CDK6和Cyclin D1，均購自美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗羊抗兔/鼠購自美國Affinity公司；ECL顯影液購自美國Millipore公司；其余試劑購自上海碧云天公司。根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計miR-3619-5p和dsControl序列，miR-3619-5p與p21基因啟動子結(jié)合區(qū)域詳見圖1；dsControl是與人類基因組無序列同源性的dsRNA[6-7]；根據(jù)Primerbank數(shù)據(jù)庫設(shè)計GAPDH、p21、CDK6和Cyclin D1的引物(表1)。

表1 miR-3619-5p、dsControl序列及qRT-PCR引物序列

圖1 miR-3619-5p與p21基因啟動子結(jié)合區(qū)域

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%飽和濕度培養(yǎng)箱中使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和T47D。根據(jù)Lipofectamine 3000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗。

1.2.2EdU細(xì)胞增殖實驗檢測乳腺癌細(xì)胞增殖能力 轉(zhuǎn)染實驗后24 h，將乳腺癌細(xì)胞以每孔6 000個接種于96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞融合度達(dá)60%。每孔加入100 μL稀釋EdU溶液，繼續(xù)孵育2 h。根據(jù)EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞固定、Apollo染色、DNA染色，熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照，隨機(jī)選取4個視野計數(shù)細(xì)胞，計算增殖率。

1.2.3集落形成實驗檢測細(xì)胞增殖能力 轉(zhuǎn)染后24 h，按1×103個/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，連續(xù)培養(yǎng)10天；PBS溶液洗3次；1 mL甲醇固定15 min；0.1%結(jié)晶紫溶液固定30 min；流水緩慢洗去結(jié)晶紫染液，空氣干燥，倒置顯微鏡下計算集落形成率。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)檢測細(xì)胞周期分布 轉(zhuǎn)染實驗后72 h，進(jìn)行胰酶消化，預(yù)冷的PBS溶液洗3次；70%乙醇溶液重懸后，置于4 ℃冰箱內(nèi)固定過夜；離心1 000 r/min，取細(xì)胞沉淀，1 mL PBS溶液洗3次；加入100 μL RNAse，37 ℃水浴箱孵育30 min；加入100 μL PI混勻，4 ℃避光孵育30 min；流式細(xì)胞儀進(jìn)行單色熒光細(xì)胞流式計數(shù)，使用Multicycle軟件(美國Beckman公司)進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1.2.5細(xì)胞凋亡檢測 轉(zhuǎn)染實驗后72 h，使用胰酶消化收集細(xì)胞，按照Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.6RNA提取及定量檢測 轉(zhuǎn)染后72 h收集乳腺癌細(xì)胞，分別用Trizol提取各組細(xì)胞RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄酶和olige(dT)逆轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，合成的cDNA使用熒光定量PCR試劑盒及特異性引物通過PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測，最終結(jié)果采用2-ΔΔCt方法分析。

1.2.7Western blot檢測細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)變化 轉(zhuǎn)染72 h后收集乳腺癌細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗3次，加入RIPA細(xì)胞裂解液，4 ℃裂解30 min，提取總蛋白。使用BCA protein assay kit測定蛋白濃度。每個樣品提取30 μg蛋白上樣，采用10%的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳分離，使用PVDF轉(zhuǎn)膜后用含5%牛血清白蛋白的TBST溶液室溫封閉后，分別與特異性一抗GAPDH(1 ∶3 000)、p21(1 ∶2 000)、CDK6(1 ∶1 000)、Cyclin D1(1 ∶2 000)在4 ℃下孵育過夜。二抗(1 ∶1 000)室溫下?lián)u床孵育；條帶滴加ECL試劑曝光顯影。

2 結(jié)果

2.1EdU細(xì)胞增殖實驗檢測細(xì)胞增殖變化與dsControl組相比，轉(zhuǎn)染miR-3619-5p后細(xì)胞EdU陽性細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05)，提示miR-3619-5p可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖能力(表2)。

表2 miR-3619-5p對乳腺癌細(xì)胞增殖能力、凋亡率的影響

miR-3619-5p組與dsControl組比較，P<0.05

2.2集落形成實驗檢測細(xì)胞增殖能力與dsControl組相比，miR-3619-5p組細(xì)胞形成的集落大小和集落數(shù)均明顯減少(P<0.01)，表明miR-3619-5p可導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞增殖能力顯著降低(表2)。

2.3FCM法檢測細(xì)胞周期分布轉(zhuǎn)染miR-3619-5p后與dsControl組相比，MCF-7和T47D細(xì)胞在S期和G2/M期細(xì)胞比例明顯減少，G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加(P<0.05，表3)，表明miR-3619-5p可抑制乳腺癌細(xì)胞周期的進(jìn)展；MCF-7和T47D細(xì)胞凋亡率明顯上升(P<0.01，表2)，提示miR-3619-5p可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡。

表3 miR-3619-5p對乳腺癌細(xì)胞周期的影響

miR-3619-5p組與dsControl組比較，P<0.05

圖2 miR-3619-5p過表達(dá)對乳腺癌不同細(xì)胞表達(dá)的影響

A.MCF-7中p21表達(dá)；B.MCF-7中CDK6表達(dá)；C.MCF-7中Cyclin D1 mRNA表達(dá)；D.T47D中p21表達(dá)；E.T47D中CDK6表達(dá)；F.T47D中Cyclin D1表達(dá)；*P<0.01

2.4qRT-PCR法檢測p21mRNA表達(dá)轉(zhuǎn)染miR-3619-5p后與dsControl組相比，MCF-7和T47D細(xì)胞中p21 mRNA的表達(dá)分別上調(diào)4.70倍(P<0.01)和3.76倍(P<0.01)；CDK6 mRNA的表達(dá)分別下調(diào)至48%(P<0.01)和42%(P<0.01)；Cyclin D1 mRNA的表達(dá)分別下調(diào)至34%(P<0.01)和28%(P<0.01，圖2)。

2.5Westenblot法檢測蛋白表達(dá)與dsControl組相比，miR-3619-5p組可見p21蛋白表達(dá)明顯升高，CDK6和Cyclin D1蛋白表達(dá)明顯降低(圖3)，提示miR-3619-5p可顯著激活乳腺癌細(xì)胞中p21蛋白的表達(dá)。

圖3 miR-3619-5p過表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞中p21、CDK6和Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響

3 討論

RNA激活作用(RNAa)是新近發(fā)現(xiàn)的小分子RNA可上調(diào)低表達(dá)基因如抑癌基因的現(xiàn)象，這一特征使RNAa具有腫瘤靶向治療研究的潛在價值[8]。與傳統(tǒng)的RNA干擾作用(RNAi)不同，RNAa的確切機(jī)制尚不明確[9]。目前最為廣泛接受的機(jī)制是具有激活作用的小分子RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，首先被裝載于Ago蛋白家族，形成有活性的Ago-RNA復(fù)合物，該復(fù)合物穿過核膜，特異性結(jié)合于靶基因啟動子區(qū)域，招募多種組蛋白修飾酶，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)打開，轉(zhuǎn)錄激活[10]。近年的研究表明，越來越多的miRNA可通過作用于基因啟動子區(qū)域，激活特定基因表達(dá)[11]。miRNAs激活作用出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后的24～48 h，在72 h達(dá)高峰，作用約可持續(xù)2周[12]。

miR-3619-5p是近年新發(fā)現(xiàn)的可抑制腫瘤生長的miRNA，目前在腫瘤中的研究較少。Niu等[5]研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌中miR-3619-5p表達(dá)水平顯著降低，β-鏈蛋白表達(dá)升高，兩者表達(dá)水平呈明顯的負(fù)相關(guān)。生物信息學(xué)分析顯示，miR-3619-5p可結(jié)合非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中β-鏈蛋白mRNA的3′-UTR以抑制其翻譯，顯著抑制癌細(xì)胞的生長和侵襲作用，有望成為非小細(xì)胞肺癌新型的抑癌因子。miR-3619-5p不僅具有干擾基因的表達(dá)，而且具有激活基因表達(dá)的作用。Li等[6]研究發(fā)現(xiàn)，miR-3619-5p可通過激活前列腺癌細(xì)胞中p21基因的表達(dá)，抑制前列腺癌細(xì)胞的生長和遷移。然而，miR-3619-5p在乳腺癌細(xì)胞中的作用未見報道。本組發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-3619-5p后乳腺癌細(xì)胞的增殖能力明顯下降，細(xì)胞周期明顯受到抑制，細(xì)胞凋亡率明顯升高。CDK6和Cyclin D1是細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，兩者可特異性結(jié)合形成CyClin D1-CDK6復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展，提高細(xì)胞的增殖能力，參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[13-14]。通過qRT-PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，CDK6和Cyclin D1的表達(dá)水平均明顯下降。p21基因在多種腫瘤中呈顯著的低表達(dá)，具有廣泛的細(xì)胞周期依賴性激酶抑制活性，可特異性的抑制Cyclin D1-CDK6復(fù)合物的形成，抑制腫瘤的生長，具有明顯的抑癌效應(yīng)[15-16]。我們通過qRT-PCR和Western blot實驗發(fā)現(xiàn)miR-3619-5p可明顯激活乳腺癌細(xì)胞中p21蛋白的表達(dá)。乳腺癌中p21蛋白表達(dá)升高導(dǎo)致CDK6和Cyclin D1的表達(dá)明顯下調(diào)，使Cyclin D1-CDK6復(fù)合物形成減少，導(dǎo)致MCF-7和T47D細(xì)胞G1期到S期進(jìn)程受阻，乳腺癌細(xì)胞周期的進(jìn)展受到抑制，增殖能力下降。miR-3619-5p是否直接通過作用于p21基因啟動子區(qū)域激活表達(dá)是本實驗分析不足，我們下一步將采用染色質(zhì)免疫共沉淀實驗驗證miR-3619-5p的靶點。同時我們也將通過動物實驗觀察miR-3619-5p在體內(nèi)對乳腺癌細(xì)胞增殖能力的抑制作用，并通過RNAi觀察下調(diào)p21基因的表達(dá)，miR-3619-5p對乳腺癌細(xì)胞生長的影響。

綜上所述，miR-3619-5p可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，其分子機(jī)制可能為通過激活乳腺癌細(xì)胞中抑癌基因p21的表達(dá)。miR-3619-5p有望成為具有乳腺癌治療應(yīng)用價值的基因工具。

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