柯柳華 張紅雨 付瑩瑩 梁卡

(柳州市中醫(yī)醫(yī)院 檢驗科，廣西 柳州 545001)

我國是出生缺陷高發(fā)國家，尤其是二孩政策頒布與實施后，高齡孕、產(chǎn)婦比例明顯增高，缺陷兒出生發(fā)生率也明顯增高。由于對優(yōu)生優(yōu)育觀念的重視，進行產(chǎn)前診斷的孕婦有逐年上升趨勢，尋找快速、準(zhǔn)確、有效的檢測技術(shù)顯得尤為重要。目前，對胎兒篩查的方式有影像學(xué)檢查、血清標(biāo)記物檢測、無創(chuàng)基因檢測，此類方法檢測率低，假陽性率高；產(chǎn)前診斷主要依靠侵入性檢查，對胎兒染色體進行核型分析，此類方法檢測率高，是產(chǎn)前檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但因是介入性的取材手術(shù)，伴有胎兒流產(chǎn)率、宮內(nèi)感染、胎兒損傷等風(fēng)險，給孕婦及家屬帶來極大的心理負擔(dān)，且不能診斷胎兒染色體微小結(jié)構(gòu)的改變。因此，在產(chǎn)檢中，如何很好地運用各項檢測技術(shù)，提高患兒檢出率，切實降低缺陷兒出生，該研究就產(chǎn)前篩查與產(chǎn)前診斷的各項檢測技術(shù)的優(yōu)劣及局限性分別做一探討，以針對孕期胎兒不同情況選擇合適有效的檢測方法。

1 產(chǎn)前超聲結(jié)構(gòu)篩查技術(shù)

產(chǎn)前超聲結(jié)構(gòu)篩查技術(shù)是應(yīng)用超聲的物理特性，對孕婦和胎兒進行影像學(xué)檢查，其主要包括B超檢查、胎兒磁共振檢查等。

1.1 B超檢查 B超檢查是產(chǎn)科中應(yīng)用最廣泛的檢查手段，它主要應(yīng)用于：①可以直觀監(jiān)測胎兒生長發(fā)育情況及觀察胎兒有無形態(tài)的異常，如胎兒神經(jīng)管發(fā)育缺陷、頭顱異常、內(nèi)臟畸形等；②確認孕周，結(jié)合血清學(xué)篩查標(biāo)志物，通過風(fēng)險計算軟件計算胎兒罹患唐氏綜合征(DS)的風(fēng)險；③用于介導(dǎo)絨毛膜取樣、羊膜腔穿刺術(shù)、臍帶穿刺術(shù)；④檢測胎兒的頸項透明層(NT)和頸部皺褶(NF)，NT和NF是目前超聲篩查唐氏綜合征最常用也是最有效的指標(biāo)[1]。NT的檢測多在孕早期(孕10～14周)，當(dāng)胎兒頸部透明層厚度大于3mm時，就考慮DS高危妊娠。此法在孕早期對于DS的檢出率約為84%。而NF主要用于孕中期(孕16～24周)的篩查，當(dāng)孕16～18周，胎兒NF厚度大于或等于5mm，孕19～24周，胎兒NF厚度大于或等于6mm時，考慮為DS高危妊娠。因此，超聲作為一種無創(chuàng)檢查方式，在產(chǎn)前篩查中一直扮演重要的角色[2]。但單以影像學(xué)作為診斷依據(jù)具有明顯局限性[3]，如在孕晚期難以穿越胎兒顱骨，肥胖、子宮肌瘤、羊水過少、多胎等情況對胎兒顯示效果下降等。

1.2 胎兒磁共振檢查 磁共振檢查具有無電離輻射、分辨率高、不受胎兒骨骼及羊水量影響的特點，對孕晚期胎頭入盆、羊水過少、雙胎、過于肥胖孕婦顯示效果不受影響，且視野大，可顯示胎兒全貌，在胎兒疾病診斷中可用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、頸胸部、腹部及盆腔等多種病變部位的診斷，尤其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病診斷方面有很高的準(zhǔn)確性，在其他部位圖像有良好的直觀性和分辨率，已成為胎兒超聲的補充手段，其不足之處是檢查時間較長、費用較貴，對胎兒心臟和四肢的診斷效果目前略差。

2 血清學(xué)篩查

血清學(xué)篩查是指通過檢測孕婦血中的相關(guān)蛋白和激素水平，結(jié)合孕婦年齡、體重、孕周、病史等，通過軟件技術(shù)，從中發(fā)現(xiàn)某些懷疑有先天畸形和遺傳性疾病胎兒的高風(fēng)險孕婦，進一步明確診斷，防止畸形胎兒的出生。篩查的項目主要有妊娠相關(guān)蛋白A(PAPP-A)、絨毛膜促性腺激素(β-HCG)、甲胎蛋白(AFP)、游離雌三醇(uE3)和抑制素A(Inh-A)等。

2.1 血清學(xué)篩查按照檢測的時間分為孕早期篩查、孕中期和序貫篩查，由于采用單個的血清標(biāo)志物用于篩查，檢出率不理想，因此在篩查中應(yīng)用較多的是多指標(biāo)的聯(lián)合篩查方案。我國篩查方案主要有孕早期、孕中期的二聯(lián)或三聯(lián)血清學(xué)檢測[4]。早期篩查的方法是PAPP-A、β-HCG和NT值三聯(lián)篩查。中期篩查方案有二聯(lián)法：β-HCG和AFP；三聯(lián)法：β-HCG、AFP和uE3。何小紅等[5]使用三聯(lián)血清生化指標(biāo)聯(lián)合胎兒超聲對2010例孕婦進行產(chǎn)前篩查，結(jié)果表明該類方法操作方便快捷，可以降低誤診率和漏診率，同時提高胎兒非整倍染色體異常檢出率和新生兒的出生質(zhì)量，吳清明等[6]亦證實聯(lián)合篩查相對簡單、無創(chuàng)、有效，是一種值得臨床推廣的產(chǎn)前篩查模式。另外，超聲結(jié)構(gòu)與血清生化指標(biāo)聯(lián)合進行篩查，是產(chǎn)前篩查的發(fā)展趨勢[7]，可提高染色體異常患兒的檢出率，有研究[8-10]指出，如果僅用B超進行篩查，21-三體綜合征的檢出率為60%～79%，但是如果B超聯(lián)合生化指標(biāo)，其檢出率可達90%，因而血清學(xué)檢查聯(lián)合使用B超檢測，可以提高染色體異常兒的檢出率，減少不必要的穿刺手術(shù)。

2.2 血清學(xué)篩查標(biāo)志物的檢測方法有時間分辨、化學(xué)發(fā)光、酶免疫法和放射免疫法等酶免疫法用呈色的深淺來反映濃度的變化，其檢測范圍比較窄，結(jié)果不穩(wěn)定，尤其對于高濃度的標(biāo)本，因超出線性，容易報告錯誤的陰性結(jié)果，導(dǎo)致對患者病情的延誤。放射免疫法也因結(jié)果變異較大，現(xiàn)大多采用時間分辨熒光免疫法和化學(xué)發(fā)光法。時間分辨熒光法為國際上最為認可的檢測方法，其采用稀土離子來標(biāo)記抗原或抗體，具有靈敏度高、制備標(biāo)志物簡便、有效期長、無放射性污染等優(yōu)點。化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法是以吖啶酯作為標(biāo)記發(fā)光劑，特異性強、敏感性高、重復(fù)性好、無放射性危害等特點。徐清芳等[11]用PerkinElmer公司時間分辨免疫熒光測定系統(tǒng)及安圖生物化學(xué)發(fā)光測定系統(tǒng)對643例孕中期孕婦血清中的AFP與Freeβ-HCG 進行二聯(lián)篩查，結(jié)果顯示兩檢測系統(tǒng)在AFP與Freeβ-HCG測定結(jié)果上相關(guān)系數(shù)R分別達到0.9797、0.989，在神經(jīng)管缺陷的判斷方面符合率為99.8%，證實時間分辨熒光免疫法與化學(xué)發(fā)光法在二聯(lián)篩查檢測上有良好的相關(guān)性。唐坤強[12]在中孕期非整倍體染色體異常血清學(xué)篩查不同方案比較中分別采用化學(xué)發(fā)光法和時間分辨熒光免疫法對513例孕婦血清進行二聯(lián)、三聯(lián)篩查，結(jié)果顯示二聯(lián)篩查中兩檢測方法差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，三聯(lián)篩查中兩檢測方法差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，證實三聯(lián)篩查方案高于二聯(lián)，時間熒光分辨法三聯(lián)篩查優(yōu)于化學(xué)發(fā)光法。

3 染色體核型分析技術(shù)

染色體體核型分析技術(shù)始于20世紀(jì)60年代末，Caspersson等發(fā)現(xiàn)植物染色體用熒光染料氮芥喹吖因染色時，染色體的不同區(qū)域顯示強弱不等熒光，隨后此技術(shù)應(yīng)用于人類染色體，揭示了人類各條染色體獨特的熒光帶型。該技術(shù)是通過超聲引導(dǎo)對孕期婦女進行絨毛膜(孕10～14周)、羊膜腔(孕16～23周)和臍靜脈(孕23周至分娩)進行穿刺取樣，通過細胞培養(yǎng)、制片和顯帶技術(shù)，觀察體細胞有絲分裂中期染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的異常，能很好地檢測出整組染色體異?；虼蠓秶娜旧w變異[13]。染色體核型分析技術(shù)雖然是診斷染色體病的金標(biāo)準(zhǔn)，但也存在以下缺陷：①檢測周期長，羊水及絨毛細胞培養(yǎng)存在細胞量少，分裂相少、易污染等問題；②對核型分析人員要求高，需要一定的技術(shù)和經(jīng)驗累積；③對于5MB以下染色體結(jié)構(gòu)異常的改變難以辨認；④在穿刺過程中易導(dǎo)致胎兒流產(chǎn)和宮內(nèi)感染(穿刺過程中可能把細菌帶入羊膜囊)。李玉[14]對3277例行羊水染色體產(chǎn)前診斷的孕中期孕婦進行追蹤，發(fā)現(xiàn)穿刺術(shù)后1個月內(nèi)流產(chǎn)的有9例，流產(chǎn)率0.27%，證實有創(chuàng)穿刺有風(fēng)險性。

4 分子遺傳學(xué)

4.1 定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(QF-PCR) QF-PCR是將PCR應(yīng)用在熒光能量的傳遞技術(shù)中，定量檢測模板，檢測反應(yīng)管中多于50個基因的RNA和DNA序列的拷貝數(shù)，該技術(shù)只需采集0.5～3ml羊水即可進行產(chǎn)前診斷，能區(qū)分出雙卵與單卵雙胎，在診斷染色體非整倍體時很少出現(xiàn)假陰性和假陽性結(jié)果。陳雁等[15]用染色體核型分析技術(shù)及QF-PCR法兩種檢測技術(shù)對731例孕婦羊水進行分析，結(jié)果表明兩者檢測方法陽性一致率達93.75%，陰性一致率達100%，非嵌合體染色體數(shù)目異常檢出率達100%，可作為染色體核型分析的補充，優(yōu)化診斷體系，但對于嵌合體尤其是比例低于30%嵌合體不適用，且不能對全基因組進行診斷。

4.2 熒光原位雜交(FISH)技術(shù) 熒光原位雜交(FISH)技術(shù)是在20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來的一種非放射性分子細胞遺傳技術(shù)，以其快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性強的特點，實現(xiàn)了快速診斷染色體異常的可能，24小時內(nèi)即可得出診斷結(jié)果，并在一定程度上避免染色體培養(yǎng)失敗的缺陷，該檢測方法是綜合了細胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)的一項新技術(shù)，主要是應(yīng)用熒光染料標(biāo)記探針DNA，變性成單鏈后與變性后的染色體或細胞核靶DNA雜交，形成可檢測的雜交雙鏈核酸，無需細胞培養(yǎng)，在細胞間期和中期均可檢測。但該檢測技術(shù)只能對21-三體、18-三體、13-三體非整倍體疾病及X染色體、Y染色體檢測，不能發(fā)現(xiàn)染色體倒位復(fù)制等情況，不能準(zhǔn)確判斷染色體嵌合體，無法替代染色體核型分析技術(shù)[16]。

4.3 無創(chuàng)產(chǎn)前DNA檢測技術(shù)(NIPT) 1997年，盧煜明等[17]發(fā)現(xiàn)孕婦血漿中有胎兒釋放的DNA，其含量占母親血漿DNA的10%～15%之高，這項檢測技術(shù)開啟了產(chǎn)前檢測新思路的技術(shù)。在國內(nèi)進行的臨床一期、二期NIPT試驗顯示，對于21-三體、18-三體、13-三體三大染色體非整倍體疾病的檢測準(zhǔn)確率高達99%以上，遠高于血清學(xué)篩查，且假陽性率、假陰性率均更低。NIPT在檢測非整倍體方面具有較高的準(zhǔn)確性，但仍只是一項高精度的篩查試驗，具有一定的漏診率與誤診率，母親體重、孕周、多胎、嵌合體均可影響NIPT的準(zhǔn)確性。在微缺失/微重復(fù)應(yīng)用NIPT檢測的可行性方面，郭可欣等[18]證實需較高的胎兒DNA濃度和更高的測序深度，當(dāng)胎兒游離DNA濃度<5%時[19]，提高測序深度也無法提高檢測敏感性，但提高測序深度會提高成本及加大假陽性率，從經(jīng)濟學(xué)角度考慮不適宜大范圍的臨床推廣。

4.4 基因芯片技術(shù) 基因芯片技術(shù)根據(jù)探針設(shè)計原理的不同分為微陳列比較基因組雜交技術(shù)(array-CGH)和多態(tài)性基因芯片技術(shù)(SNP-array),具有分辨率高的特點，但基因芯片制作難度大、成本高，且只能檢測出已知的異常。

4.4.1 微陳列比較基因組雜交技術(shù)(array-CGH) Array-CGH作為新興的分子技術(shù)，具有精準(zhǔn)、快速的優(yōu)點，該技術(shù)是通過在一微小的基片表面固定大量的基因探針，待檢測樣品標(biāo)記后與已固定的核苷酸序列進行雜交，根據(jù)檢測信號的有無和強弱，確定樣品中該基因或核苷酸序列的含量。它可檢測到染色體的微重復(fù)和微缺失，還能提供人類全基因組亞顯微水平的信息(拷貝數(shù)變異)，是診斷胎兒染色體微缺失/微重復(fù)綜合征的有效方法，因此又稱為“分子核型分析”，與傳統(tǒng)的染色體核型分析相比，其顯著的優(yōu)點是無需培養(yǎng)、所需樣本量少、分辨率高、報告周期短等，不足之處是不能檢出平衡倒位、平衡易位或低比例嵌合的病例。

4.4.2 多態(tài)性基因芯片技術(shù)(SNP-array) SNP-array主要用于基因分型及全基因組的關(guān)聯(lián)分型，其采用DNA線性擴增法將微量基因組DNA擴增，再將DNA單鏈與探針條件性互補雜交，并采用單堿基延伸、熒光抗體與標(biāo)記的摻入堿基特異性識別結(jié)合，檢測全基因組范圍內(nèi)約30萬個SNPA位點的基因型和基因劑量，由此判斷可能存在的染色體劑量變化。其優(yōu)點是可以對全基因組進行高分辨率掃描，最高檢測分辨率可達到10K，遠高于臨床現(xiàn)用的G顯帶法(>5Mb),可以實現(xiàn)染色體微缺失/微重復(fù)的檢測，并可以對標(biāo)記染色體、衍生染色體等存在未明染色體片段的遺傳物質(zhì)進行精確的定位和定量，有助于臨床診斷，是一種功能強大的遺傳學(xué)檢測技術(shù)。

5 結(jié)語

細胞遺傳學(xué)技術(shù)能診斷細胞整組染色體的數(shù)目異常和染色體結(jié)構(gòu)改變, 為核型分析的金標(biāo)準(zhǔn)，受顯帶分辨率的限制，只能觀察到長度>10Mb的結(jié)構(gòu)變異。FISH技術(shù)只能定向?qū)?1、18、13號常染色體和X、Y性染色體異常進行檢測。NIPT目前亦是對21、18、13號染色體的檢測，有較最高的檢出率和最低的假陽性率，從孕10周即可進行檢測，直至孕22周，而其他篩查檢測只能在懷孕期間特定一小段窗口期內(nèi)進行，另外，NIPT不能篩查開放性神經(jīng)管缺陷等胎兒發(fā)育異常，需輔助B超檢查?；蛐酒夹g(shù)相對于其他檢測技術(shù)則顯示了較大的優(yōu)勢，不僅可以對全基因組進行高分辨率的掃描，還可以檢測到微缺失、微重復(fù)。綜上所述，產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷各項檢測技術(shù)各有優(yōu)劣，血清學(xué)產(chǎn)前篩查高危孕婦需在遺傳學(xué)咨詢醫(yī)生的指導(dǎo)下，根據(jù)自身情況進行進一步的產(chǎn)前診斷檢查，切實降低缺陷兒的出生，提高我國人口質(zhì)量。

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