吳則東 ，馬龍彪 ，周艷麗 ，張文彬

（1.黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，哈爾濱150080；

2.黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱150080）

甜葉菊是產(chǎn)于巴拉圭與巴西的多年生主要的保健用草本植物，含有的調(diào)節(jié)和維持人體內(nèi)各種代謝過程所必需的重要營養(yǎng)素和礦物質(zhì)[1]。甜菊糖（steviol glycosides，SGs）以純天然、零卡路里、熱穩(wěn)定、對血糖無影響、非可發(fā)酵、酸堿性穩(wěn)定、比普通糖甜150～300倍、防齲齒、無褐變反應(yīng)和無脂肪與碳水化合物十大優(yōu)點(diǎn)，受到全球消費(fèi)與開發(fā)者的青睞[2]。甜葉菊葉片的天然成分主要是貝殼杉烯二萜苷：甜菊糖苷（stevioside，STV），萊鮑迪苷A（Reb A）、B、C、D、E，杜爾可苷A和甜菊雙糖苷。其中較甜的四環(huán)二萜甜菊糖是STV和Reb A，這些苷是由一個二萜貝殼杉烯骨架連接大量葡萄糖單元組成。幾乎30種貝殼杉烯二萜苷已從不同種甜葉菊植物中提取，通常被稱為甜菊醇糖苷（steviol glycosides），即以甜菊醇（steviol，ent-13-羥基貝杉?xì)は┧幔榛A(chǔ)配糖苷，C19酯鍵參與C19安息香酸功能和葡萄糖單元之間連接，C13羥基團(tuán)與葡萄糖、木糖、鼠李糖結(jié)合形成乙醚鍵。Reb A比STV有更多的葡萄糖[3]。葡萄糖和槐糖基殘基存在于STV，與糖苷配基甜菊醇連接，最后呈現(xiàn)環(huán)戊烷多氫菲的骨架。甜菊醇（steviol）的C4和C13分別與β-葡糖基和β-槐糖基團(tuán)連接。Reb A與STV具有相同的基本結(jié)構(gòu)，唯一不同的是葡糖基-（1-3）-槐糖基殘基替換了槐糖基殘基[3]。STV（三糖苷甜菊醇）是最主要的貝殼杉烯型二萜苷，占干葉含量的3%～8%，Reb A比其它甜菊糖更甜、味道更美[3]。

1　甜菊糖生物合成途徑

甜菊葉的甜度是由于次生代謝物甜菊糖的存在。STV和Reb A是各種甜菊糖（SGs）的重要代謝產(chǎn)物。甜菊糖的生物合成途徑涉及16個步驟，是由眾多的酶催化，其中4個UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶（UGTs）為UGT85C2、UGT74G1、UGT76G1 和貝殼杉烯酸-13-羥化酶（KAH）[4]。與赤霉素（GA）的生物合成途徑有關(guān)[5]。甜菊糖（SGs）主要存在于甜葉菊葉片中，少量在莖中，根中幾乎沒有[6]。甜菊糖的生物合成主要涉及7個步驟與MEP（2-cmethyl-d-erythritol-4-phosphate）的異戊烯焦磷酸（IPP）、二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）和香葉基焦磷酸（GGDP）合成途徑相似[7]；隨后，接下來的4個步驟與赤霉素（GA）的生物合成途徑中涉及到從GGDP到貝殼杉烯酸的合成相似；最后5個步驟包括甜菊醇糖苷（steviol glycoside）的生物合成途徑[3]。

在柯巴基焦磷酸（CDP）合成酶（CPS）存在下，GGDP最初通過質(zhì)子化引發(fā)環(huán)化將CDP轉(zhuǎn)換為甜菊醇（steviol），隨后，貝殼杉烯合成酶（KS）產(chǎn)生貝殼杉烯。進(jìn)一步，通過3步反應(yīng)貝殼杉烯經(jīng)貝殼杉烯氧化酶（KO）氧化為異貝殼杉烯酸，像GA的生物合成一樣[8]。在甜葉菊植株的花、葉、肉質(zhì)莖和嫩枝中KO含量極高[5]。最后，通過異貝殼杉烯酸-13-羥化酶（KAH）作用將異貝殼杉烯酸羥基化。在這一步中，甜菊糖（SGs）生物合成與赤霉素（GA）生物合成開始分支[9]。

在細(xì)胞質(zhì)中，糖苷配基甜菊醇由不同的糖基轉(zhuǎn)移酶（UGT）糖基化。在甜菊醇有兩個羥基團(tuán)，分別在C-4羧基的C-19位和C-13位。在UGT85C2催化下開始對甜菊醇的C-13糖基化產(chǎn)生甜菊醇單糖苷，再糖基化產(chǎn)生甜菊醇雙糖苷，UGT催化此步還沒有確定。最后，在UGT74G1催化下將甜菊醇雙糖苷C-19糖基化形成甜菊醇三糖苷（即STV）。那么，Reb A是由UGT76G1酶催化下將STV的C-13糖基化生成的[9]。

2　STV糖基化為Reb A

Reb A因其具有高甜度，口感好，口味好，無任何不良余味，是商業(yè)上最受青睞和開發(fā)價值的SGs，因此用酶催化甜葉菊葉片將STV糖基化努力提高Reb A的含量。試驗(yàn)表明，添加1%可溶性淀粉、1%纖維素酶到反應(yīng)混合物（0．1 M 磷酸鈉緩沖液 pH 4．6），葉片與緩沖液比為 1∶15，然后在 50℃孵育，在 100～120℃、10 kPa壓力和90 r/min 10～15 min將甜菊葉加壓熱水提取（PHWE）SGs。結(jié)果證實(shí)，STV的糖基化轉(zhuǎn)化為Reb A，使Reb A含量從4%提高到66%。進(jìn)一步凈化多柱色譜分離得到95%純Reb A。Reb A濃度與α-葡萄糖苷酶有關(guān)，抑制活性IC50=35．01lg/mL。因此，STV轉(zhuǎn)化Reb A的過程簡單、廉價和環(huán)保，具有商業(yè)潛力[10]。

甜菊葉經(jīng)纖維素酶預(yù)處理水解葉細(xì)胞壁，釋放胞內(nèi)的甜菊醇糖苷、α-淀粉酶和轉(zhuǎn)糖苷酶[11]。釋放的α-淀粉酶水解可溶性淀粉為葡萄糖釋放到介質(zhì)中，這些葡萄糖分子然后轉(zhuǎn)移到STV的C-13位由葡糖基轉(zhuǎn)移酶催化而獲得高收益的Reb A，從而提高提取的SGs甜度[12]。當(dāng)添加純的STV到反應(yīng)混合物（含有纖維素酶和可溶性淀粉）中做底物，轉(zhuǎn)糖基化并沒有進(jìn)行。這可能是反應(yīng)介質(zhì)中由于缺乏胞內(nèi)酶（α-淀粉酶和糖基轉(zhuǎn)移酶）。這也證明了介質(zhì)中纖維素酶不負(fù)責(zé)STV的轉(zhuǎn)糖基催化。經(jīng)纖維素酶預(yù)處理，葉片釋放的糖基轉(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)催化轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)，從而提高Reb A的生產(chǎn)[10]。

在人類，味覺接收有5種：甜、甘、苦、咸和酸。味覺受體細(xì)胞（TRCs）和信令單元已被確認(rèn)在口腔、味蕾在舌[13]。甜味受體（STR）屬于G蛋白偶聯(lián)受體C類（C-GPCR）家族[14]。在異種受體hTAS1R2 and hTAS1R3蛋白相結(jié)合激活下，開始感覺甜味[15]。與甜味的單受體探測比，苦味受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體的卷曲受體家族[16]。它們表現(xiàn)出獨(dú)特的，但部分重疊分子接受范圍，因?yàn)槿祟惪辔秇TAS2R基因家族的25受體已被轉(zhuǎn)導(dǎo)在染色體簇 5p15、7q31 和 12p13[17]。 hTAS2Rs的氨基酸長 290～333 個，有 7 個跨膜螺旋（TM1～TM7），位于短胞外氨基端和胞內(nèi)羧基末端[18]。在25個受體中，hTAs2R4受體受STV和Reb A的活化作用參與苦味接受[19]。但是，苦味背后的分子結(jié)構(gòu)機(jī)制依舊不為人知。酶法合成引起了相當(dāng)?shù)闹匾?，在綠色環(huán)保發(fā)展起重要作用。酶法改性的過程中，在一個糖殘基轉(zhuǎn)移到另一個糖苷期間形成糖苷鍵[20]。R Singla等已經(jīng)開發(fā)出一種苦味受體同源性模型和測定苦味受體活化配體的結(jié)構(gòu)，提出了STV酶生物轉(zhuǎn)化Reb A的合成策略，以β-1,3-葡聚糖酶合成了Reb A。酶的糖基化需要兩個步驟，第一步是β-1,3-葡聚糖酶將凝膠多糖做供體分解為葡萄糖部分，第二步是在STV的C-3位置有選擇性進(jìn)行β配置。溫度、pH值、時間、多糖和酶的濃度在產(chǎn)品產(chǎn)量起著重要的作用。STV 與多糖的比例為采取 1∶2，優(yōu)化反應(yīng)條件：55℃、pH 4．5、檸檬酸緩沖液，反應(yīng)時間為 3h。在 3．425單位/克酶活性下反應(yīng)產(chǎn)物達(dá)最大產(chǎn)量，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)柱層析純化，轉(zhuǎn)化率為62．5%[21]。

3　甜菊糖的生物轉(zhuǎn)化

對貝殼杉烯二萜苷的生物轉(zhuǎn)化研究表明，人類和動物中STV和Reb A可安全地代謝而未被吸收利用[22]。由于STV的分子量高，人體小腸不容易吸收，不易被胃腸道消化酶分解為甜菊醇。STV或通過盲腸或結(jié)腸的菌群降解產(chǎn)生游離甜菊醇，或在肝臟進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為葡萄糖醛酸衍生物通過尿液排出[23]。體外方法測定各種消化酶消化STV的研究表明，在腸道的菌群沒有消化酶消化STV，但將其水解產(chǎn)生甜菊醇和甜菊醇-16-α-17-環(huán)氧化物，最后，甜菊醇-16-α-17-環(huán)氧化物完全轉(zhuǎn)化為甜菊醇和甜菊醇葡萄糖醛酸從尿液中排出[24]。

Reb A通過結(jié)腸微生物代謝為STV，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為葡萄糖分子和甜菊醇。結(jié)腸的細(xì)菌或Bacteroides sp．將釋放的葡萄糖分子利用而不被身體吸收進(jìn)入血液和代謝成分基本上離開身體[25]。甜葉菊的最終代謝產(chǎn)物是甜菊醇，通過人的糞便，并不改變代謝濃度。主要的甜菊糖（STV和Reb A）在肝臟吸收和葡糖醛酸化，一小部分留下結(jié)腸做糞便排泄，葡糖苷酸是釋放在血液通過腎臟過濾進(jìn)入尿液[26]。在個別物種STV轉(zhuǎn)化為甜菊醇比Reb A轉(zhuǎn)化為STV更快速[3]。此外，定量和定性在大鼠機(jī)體和人體的腸道（菌群）中都發(fā)現(xiàn)了相似之處。

4　甜菊糖苷的未來微生物工廠化生產(chǎn)

Reb A甜度雖高，但高濃度回味仍具苦味，Reb C的甜度僅是葡萄糖的30倍，含量低的五糖苷Reb D和六糖苷Reb M及其共混物甜度高達(dá)蔗糖的350倍，并極大降低了苦味。Reb D明顯比Reb B甜且苦味低，與Reb A、B相比，Reb M具高甜度、快速和干凈的味道，且苦味極低。這些特性使Reb D和Reb M成為優(yōu)質(zhì)的高潛力的天然甜味劑。Reb D和Reb M在甜葉菊葉含量極低（約0．5%），從甜葉菊中提取是不切實(shí)際和昂貴的。STs的Reb D和Reb M生物合成途徑已在酵母中成功表達(dá)，微生物提供了Reb D和Reb M的異源生產(chǎn)替代[27]。因此，利用微生物實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)下一代高甜度甜菊糖甜味劑，是未來的發(fā)展方向。

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