魏雨晴，呂鏜烽，劉紅兵，宋 勇

（南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院，南京大學(xué)呼吸病學(xué)研究所，南京210002）

0 引言

肺癌是導(dǎo)致人類癌性死亡的首要疾病，肺癌的發(fā)生率和死亡率居男性癌癥的第一位，在女性癌癥患者中發(fā)生率位居第四，死亡率位居第二［1］。肺癌分為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（small cell lung cance，SCLC）兩大類型，其中NSCLC患者比例約為85%，約80%的患者被確診為肺癌時(shí)已處于晚期［2］。含鉑兩藥化療方案是大多數(shù)晚期無(wú)基因突變非小細(xì)胞肺癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，患者的中位生存期約為10個(gè)月［3］，而對(duì)于一些敏感基因突變的患者，靶向療法已成為其標(biāo)準(zhǔn)治療方案（如EGFR基因突變的患者，靶向EGFR-TKIs治療中位總生存率約為20個(gè)月）［4-5］。進(jìn)展期及轉(zhuǎn)移性肺癌的預(yù)后極差，5年預(yù)后生存率僅為15%左右［6］。近兩年來(lái)，以PD-1／PD-L1為主的免疫檢查點(diǎn)抑制劑藥物的研究與應(yīng)用迅速興起，PD-L1蛋白與免疫細(xì)胞受體PD-1結(jié)合形成類似汽車剎車的作用，可降低T細(xì)胞的免疫功能從而使腫瘤發(fā)生免疫逃逸［7］，拮抗PD-1與PD-L1之間的結(jié)合，阻斷負(fù)向調(diào)控信號(hào)，則可以增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)源性的抗腫瘤免疫效應(yīng)。腫瘤的PD-L1表達(dá)水平作為可能的潛在預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物備受矚目。PD-L1（又稱B7-H1，CD274）屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，臨床數(shù)據(jù)［8］表明PD-L1在胃癌、肝細(xì)胞癌、腎細(xì)胞癌、食管癌、胰腺癌、卵巢癌及膀胱癌中過(guò)表達(dá)提示預(yù)后不良，在乳腺癌及默克爾細(xì)胞癌中有著很好的臨床預(yù)后，而在肺癌、結(jié)直腸癌及黑色素瘤中的預(yù)后價(jià)值仍有爭(zhēng)議，有些患者PD-L1低表達(dá)卻仍對(duì)PD-1／PD-L1通路抑制劑應(yīng)答有效。因此如何有效地選擇合適的患者進(jìn)行治療十分重要，尤其是如何尋找PD-L1陽(yáng)性的最佳cut-off值?，F(xiàn)本文將對(duì)PD-L1作為NSCLC預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物的意義及其局限性作出如下綜述。

1 PD-1／PD-L1信號(hào)通路的生物學(xué)特征

機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視與排斥功能在清除惡性腫瘤細(xì)胞中起著極其重要的作用，可通過(guò)識(shí)別腫瘤特異性抗原，產(chǎn)生T細(xì)胞免疫應(yīng)答從而清除腫瘤細(xì)胞［9］。到目前為止，已經(jīng)提出有多種機(jī)制導(dǎo)致無(wú)效的抗腫瘤免疫：抗原提呈機(jī)制的下調(diào)、免疫編輯、自身免疫耐受的產(chǎn)生以及腫瘤微環(huán)境中免疫檢查點(diǎn)的上調(diào)［10］。2012年anti-PD-1抗體首次臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)表，并完善了PD-1／PD-L1途徑的腫瘤免疫調(diào)節(jié)機(jī)制：介導(dǎo)腫瘤局部的獲得性免疫逃逸［11］。PD-1是屬于CD28免疫球蛋白超家族的Ⅰ型跨膜糖蛋白，是一種負(fù)性共刺激分子，通常以單體的形式表達(dá)于激活的CD4+／CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞表面。PD-1有兩個(gè)配體：PD-L1和PD-L2，均為含IgC和IgV胞外結(jié)構(gòu)域的Ⅰ型跨膜糖蛋白，具有40%的氨基酸同源性［12］。 PD-L1（B7-H1）是 PD-1 最主要的配體，屬于B7超家族，在免疫細(xì)胞（如腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞）和上皮細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞）表面誘導(dǎo)性表達(dá)［13-14］。PD-L1在正常組織中幾乎不表達(dá)，卻能誘導(dǎo)性地表達(dá)于腫瘤組織［15］，而這也正是PD-L1通路與其他共抑制信號(hào)通路的不同之處，研究［8］表明腫瘤患者選擇性表達(dá)PD-L1與其臨床預(yù)后有一定的關(guān)聯(lián)。

2 PD-L1在NSCLC組織中的表達(dá)及相關(guān)性分析

2015年10月，美國(guó)FDA批準(zhǔn)用兩種不同的免疫組織化學(xué)（Immunohistochemical，IHC）方法測(cè)定被福爾馬林固定及石蠟包埋的NSCLC組織中的PD-L1的表達(dá)，分別是Dako PD-L1 IHC 22C3 pharmDx和Dako PD-L1 IHC 28-8 pharmDx，這兩種檢測(cè)方法相應(yīng)與Pembrolizumab（Keytruda，默沙東）、Nivolumab（Opdivo，BMS）相結(jié)合［16］。下面主要通過(guò)介紹3個(gè)大型臨床研究來(lái)分析NSCLC患者PD-L1的表達(dá)。

2．1 KEYNOTE-001 研究 KEYNOTE-001 研究［17］是一項(xiàng)大型的國(guó)際Ⅰ期臨床試驗(yàn)，其評(píng)估了PD-1檢查點(diǎn)抑制劑Pembrolizumab治療晚期NSCLC的安全性和有效性，同時(shí)確定和證實(shí)腫瘤PD-L1表達(dá)水平與Pembrolizumab治療獲益相關(guān)。該研究共納入101名年齡≥18歲的無(wú) EGFR／ALK突變的Ⅳ期 NSCLC患者，應(yīng)用抗PD-L1抗體克隆22C3和原型免疫組化分析來(lái)判定 PD-L1狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：27名患者的TPS≥50%，52名患者的TPS為1%～49%，12名患者的TPS＜1%；客觀緩解率為27%，中位總生存期為22．1個(gè)月；PD-L1 TPS≥50% 的患者客觀緩解率（objective response rate，ORR），12個(gè)月無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）以及12個(gè)月總體生存期（overall survival， OS）分別為 51．9%、54%、85%，較整體水平明顯提高（分別為26．7%、35%、71%），僅有12名患者（11．9%）出現(xiàn)了3／4級(jí)治療相關(guān)不良反應(yīng)，未出現(xiàn)治療相關(guān)死亡。該研究結(jié)果提示，Pembrolizumab單藥治療的耐受性良好，在NSCLC患者中表現(xiàn)出較好的抗腫瘤活性，Pembrolizumab治療獲益與腫瘤PD-L1的表達(dá)情況呈正相關(guān)。

2．2 Checkmate 057 研究 Checkmate 057 研究［18］是一項(xiàng)隨機(jī)開(kāi)放的國(guó)際Ⅲ期臨床試驗(yàn)，主要針對(duì)非鱗狀非小細(xì)胞肺癌患者正在使用或已使用含鉑兩藥方案化療分別予以Nivolumab和多西他賽單藥治療，應(yīng)用抗PD-L1抗體克隆28-8和原型免疫組化分析來(lái)判定PD-L1狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Nivolumab組的中位生存時(shí)間為 12．2 個(gè)月（95%CI 9．7-15．0），高于多西他賽組中位生存時(shí)間［9．4 個(gè)月（95%CI 8．1-10．7）］；Nivolumab組的1年生存率為51%，而多西他賽組的1年生存率為39%；Nivolumab組的有效率為19%vs多西他賽組的12%（P＝0．02）；雖然中位 PFS結(jié)果顯示Nivolumab組并不優(yōu)于多西他賽組（2．3個(gè)月vs 4．2個(gè)月），但是一年無(wú)進(jìn)展生存率明顯高于多西他賽組（19%vs 8%）；安全性方面，Nivolumab組發(fā)生與治療相關(guān)的3～4級(jí)毒性反應(yīng)的患者占10%，而多西他賽組占54%；根據(jù)預(yù)先指定的PD-L1表達(dá)級(jí)別（≥1%，≥5%，≥10%）所分亞組結(jié)果提示：Nivolumab在所有終點(diǎn)事件中較多西他賽均顯示出更好的療效。該研究表明，Nivolumab的療效與PD-L1的表達(dá)有相關(guān)性，PD-L1表達(dá)＞1%陽(yáng)性者療效優(yōu)于表達(dá)陰性者。2．3 KEYNOTE024 研究 KEYNOTE024 研究［19］也是一項(xiàng)隨機(jī)開(kāi)放的國(guó)際臨床Ⅲ期試驗(yàn)，旨在評(píng)價(jià)Pembrolizumab較標(biāo)準(zhǔn)的含鉑化療應(yīng)用于無(wú)EGFR及ALK驅(qū)動(dòng)基因突變但高表達(dá)PD-L1（≥50%）的晚期NSCLC初治患者的有效性及安全性。研究發(fā)現(xiàn)：Pembrolizumab組的中位 PFS為 10．3個(gè)月（95%CI 6．7-未達(dá)到），而化療組的中位 PFS為 6．0個(gè)月（95%CI 4．2-6．2）；Pembrolizumab 組 6 個(gè)月的 OS 為 80．2%，化療組為72．4%；Pembrolizumab組和化療組的有效率為44．8%vs 27．8%；Pembrolizumab 組發(fā)生治療相關(guān)3／4／5 級(jí)不良反應(yīng)比例為26．6%，化療組為53．3%，以上數(shù)據(jù)表明：與使用以鉑類為基礎(chǔ)的化療方案相比，晚期 NSCLC患者（PD-L1表達(dá)≥50%）使用Pembrolizumab有優(yōu)越的有效性和安全性，能夠明顯延長(zhǎng)PFS和OS，不良反應(yīng)相對(duì)較輕。這項(xiàng)研究具有里程碑式的意義，基于此，2016年 10月 24日，F(xiàn)DA批準(zhǔn)Pembrolizumab（Keytruda）用于 PD-L1高表達(dá)（≥50%）的非小細(xì)胞肺癌患者的一線治療。

3 PD-L1作為NSCLC預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物的局限性及潛在標(biāo)志物

在蛋白質(zhì)水平層面表達(dá)的PD-L1［20］，雖然是目前最常用的免疫療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物，但仍存在一定的局限性，表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。

首先，免疫組化檢測(cè)的PD-L1表達(dá)水平在臨床中有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，但由于在定義PD-L1染色陽(yáng)性的過(guò)程中存在個(gè)人主觀性［21］，使得免疫組化染色不能準(zhǔn)確地反映出PD-L1的真實(shí)表達(dá)水平，不同的研究中使用不同的單抗，使得定義PD-L1免疫組化染色陽(yáng)性的臨界值不同。一些研究［17-18］中，達(dá)到最佳治療的臨界值設(shè)為50%腫瘤相關(guān)PD-L1和10%免疫細(xì)胞相關(guān)PD-L1，而另外一項(xiàng)研究［22］中將腫瘤相關(guān) PD-L1表達(dá)水平臨界值設(shè)為1%。此外，由于免疫組化檢測(cè)存在技術(shù)缺陷，造成PD-L1免疫組織化學(xué)染色精確度低的因素包括以下三點(diǎn)：第一，染色抗體多樣，不同的研究中使用的抗體包括 M1H1、5H1、5H1-A3、2H11、27A2、405．9A11 和 E1L3N［23-29］，不同抗體在不同的研究中的敏感性和親和力是不同的。第二，在不同的研究中，PD-L1染色陽(yáng)性的cut-off值不同。第三，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)平臺(tái)的不同也會(huì)使PD-L1檢測(cè)存在差異。目前，國(guó)外已有4種特異性PD-L1平臺(tái)檢測(cè)技術(shù)：Dako Link 48平臺(tái)上作22C3檢測(cè)、Dako Link 48平臺(tái)上作28-8檢測(cè)、Ventana Benchmark平臺(tái)上作SP142檢測(cè)以及Leica Bond平臺(tái)上作E1L3N檢測(cè)（實(shí)驗(yàn)室研發(fā)檢測(cè)技術(shù)）。FDA目前已批準(zhǔn)Dako Link 48平臺(tái)上28-8抗體特異性與nivolumab結(jié)合，Dako Link 48平臺(tái)上22C3抗體特異性與pembrolizumab結(jié)合，Ventana Benchmark平臺(tái)上SP142抗體特異性與atezolizumab結(jié)合。Rimm等［30］比較了這四種檢測(cè)抗體、檢測(cè)平臺(tái)在測(cè)定PD-L1時(shí)準(zhǔn)確性和可靠性的差異，評(píng)價(jià)了腫瘤細(xì)胞表面與免疫細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)的差異以及病理學(xué)家對(duì)不同方法結(jié)果解讀的差異，其研究發(fā)現(xiàn)：22C3、28-8及E1L3N檢測(cè)結(jié)果具有一致性，而SP142只能檢測(cè)出其他三種檢測(cè)方法檢測(cè)出的陽(yáng)性病例的50%。且SP142無(wú)論在腫瘤細(xì)胞還是在免疫細(xì)胞上的PD-L1表達(dá)平均分上，均顯著低于其它三種檢測(cè)方法。配對(duì)比較顯示28-8和E1L3N檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異，22C3比28-8或E1L3N在檢測(cè)PD-L1表達(dá)水平上顯著要低，但是只采用13位病理學(xué)家評(píng)分的平均值時(shí)，22C3比28-8或E1L3N在檢測(cè)PD-L1表達(dá)水平上有統(tǒng)計(jì)意義的輕度降低。病理學(xué)家在對(duì)腫瘤細(xì)胞染色的評(píng)分上顯示出高度的一致性，但對(duì)免疫細(xì)胞抗體染色評(píng)分上一致性很差，提示免疫組化中無(wú)論選擇哪種檢測(cè)抗體和平臺(tái)，對(duì)免疫細(xì)胞上表達(dá)的PDL1的評(píng)價(jià)仍然不足。腫瘤細(xì)胞以50%為檢測(cè)閾值比1%為閾值有更高的一致性。1%的檢測(cè)閾值要求病理學(xué)家使用自動(dòng)化系統(tǒng)或經(jīng)培訓(xùn)的方法改進(jìn)檢測(cè)的精確度。從上述研究結(jié)果來(lái)看，四種檢測(cè)方法中的三種（抗體22C3、28-8和E1L3N）結(jié)果是可以互換的，但是目前臨床上尚沒(méi)有一種檢測(cè)方法在交叉利用上得到證實(shí)。

其次，腫瘤細(xì)胞和某些免疫細(xì)胞群均可以表達(dá)PD-L1［31］。 有研究［32］表明某些 PD-1／PD-L1 抑制劑的敏感性與免疫細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平相關(guān)，因此對(duì)免疫細(xì)胞表達(dá)的PD-L1水平的評(píng)估顯得更為重要。在適應(yīng)性免疫反應(yīng)方面，免疫細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞）相關(guān)PD-L1表達(dá)的預(yù)測(cè)意義與腫瘤相關(guān)的PD-L1表達(dá)不同［32］。此外，腫瘤細(xì)胞PD-L1高表達(dá)和免疫細(xì)胞PD-L1低表達(dá)與肺腺癌患者較差預(yù)后有關(guān)［33］。因此，對(duì)于如何去鑒別浸潤(rùn)位于腫瘤細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間的免疫細(xì)胞、存在于侵襲性腫瘤細(xì)胞邊界或腫瘤塊周邊的免疫細(xì)胞以及存在于實(shí)質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞聚集處且遠(yuǎn)離腫瘤塊的免疫細(xì)胞很有必要。

然后，由于腫瘤具有異質(zhì)性，腫瘤的PD-L1表達(dá)在原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移病灶中是不同的。腫瘤PD-L1表達(dá)有兩種形式：集中表達(dá)和分散表達(dá)。在許多腫瘤中，即使在同一標(biāo)本中取材，不恰當(dāng)?shù)幕顧z也會(huì)導(dǎo)致PD-L1表達(dá)檢測(cè)的偏差，評(píng)估PD-L1表達(dá)在腫瘤內(nèi)還是腫瘤外同樣也是一個(gè)難題，因此選擇合適的活檢部位對(duì)于檢測(cè)PD-L1表達(dá)是一個(gè)挑戰(zhàn)，需要更深入地研究和探討［34］。一些臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PD-L1高表達(dá)是判斷療效的一個(gè)很好的指標(biāo)，包括惡性黑色素瘤、NSCLC和RCC都能看到PD-L1高表達(dá)的患者更容易獲益［35-38］。但是，仍有PD-L1低表達(dá)的患者有很好的響應(yīng)［39］。如何篩選出這部分患者，仍是一個(gè)未解難題。

最后，有研究［32，40］顯示，僅有胞膜表達(dá)的 PD-L1有生物學(xué)意義，無(wú)論是通過(guò)動(dòng)態(tài)IFN-γ表達(dá)還是通過(guò)組成型癌基因激活表達(dá)。與癌基因介導(dǎo)的PD-L1表達(dá)相反，IFN-γ誘導(dǎo)的PD-L1表達(dá)代表著一種動(dòng)態(tài)生物標(biāo)志物，且出現(xiàn)在活動(dòng)性炎癥部位。因此，分析胞膜上的PD-L1蛋白與臨床預(yù)后之間的關(guān)系要比胞內(nèi)PD-L1蛋白或mRNA更合理。

4 潛在的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物

2015年ASCO公布了一項(xiàng)Ⅱ期臨床試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)基因預(yù)測(cè)標(biāo)志物-錯(cuò)配修復(fù)（mismatch-repair，MMR）基因缺失能夠有效預(yù)測(cè)PD-1抑制劑的療效。MMR是在遺傳性非息肉性大腸癌中分離得到的一組遺傳易感基因，該基因突變會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)配修復(fù)功能缺陷，進(jìn)而出現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability，MSI），因而容易發(fā)生腫瘤。 Diaz 等［41］發(fā)現(xiàn) pembrolizumab治療錯(cuò)配修復(fù)基因缺陷型腫瘤比含有錯(cuò)配修復(fù)基因型腫瘤更有效。并提出了解釋這個(gè)現(xiàn)象的假設(shè)：錯(cuò)配修復(fù)缺陷型腫瘤中突變相關(guān)的新抗原數(shù)量的增加刺激了抗腫瘤免疫反應(yīng)。用PD-1單抗治療具有錯(cuò)配修復(fù)基因缺陷型腫瘤可以鑒別特異性基因組改變并預(yù)測(cè)此治療的原發(fā)性耐藥。眾所周知，錯(cuò)配修復(fù)缺陷型結(jié)直腸癌編碼Ⅱ型轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor β， TGF-β）受體，而 TGF-β 信號(hào)通路被廣泛地研究于包括腫瘤免疫在內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)［42］。MMR的發(fā)現(xiàn)為免疫治療和基因組學(xué)搭建了一座橋梁。 有研究［43］證實(shí)，CD28／B7共刺激途徑對(duì)于腫瘤小鼠和慢性病毒感染期間有效的PD-1治療至關(guān)重要，腫瘤特異性的T細(xì)胞需要CD28分子的共刺激（co-stimulation）進(jìn)行增殖和恢復(fù)有效的免疫反應(yīng)，腫瘤患者抗PD-1治療后血液中CD8 T細(xì)胞增殖主要為CD28陽(yáng)性，這項(xiàng)研究的發(fā)現(xiàn)表明存在于T細(xì)胞表面的CD28可能作為PD-1靶向藥物是否有效的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。CD8+T淋巴細(xì)胞和IFN-γ因其在腫瘤微環(huán)境中的重要作用也被作為候選預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物［44-45］。

5 總結(jié)與展望

免疫治療是繼化療、放療、手術(shù)等傳統(tǒng)治療和分子靶向治療后的又一治療手段，已經(jīng)成為當(dāng)前全世界研究熱點(diǎn)。確定預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物有助于患者篩查和個(gè)體化治療。雖然PD-L1是目前最常用的免疫療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物，但其檢測(cè)仍存在一定的局限性，不能作為明確的標(biāo)志物，未來(lái)我們需要進(jìn)行更深入的研究來(lái)驗(yàn)證PD-L1作為預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物的可行性，研制出一種囊括多層面的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物體系，將諸如PD-L1檢查點(diǎn)抑制劑、腫瘤突變負(fù)荷、腫瘤免疫微環(huán)境等整合起來(lái)，以篩選出最適合進(jìn)行免疫治療的人群，將免疫治療個(gè)體化、最優(yōu)化。

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