郭晉杰，陳景堂

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/國家玉米改良中心河北分中心/河北省作物種質(zhì)資源實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000）

玉米的容重是國際玉米商品品質(zhì)的衡量指標(biāo)。郭淑春等［1］研究表明，不論是什么品種，也不論是哪種粒型，玉米容重都與營養(yǎng)成分成正比，尤其是蛋白質(zhì)含量，其容重隨著蛋白質(zhì)含量的增加呈上升趨勢。所以，容重是最能體現(xiàn)玉米成熟度的指標(biāo)。為使玉米的商品品質(zhì)與國際接軌，我國于1999年制定了新的玉米定等標(biāo)準(zhǔn)，以容重作為衡量玉米商品品質(zhì)好壞的標(biāo)準(zhǔn)。外觀品質(zhì)與容重極顯著正相關(guān)，籽粒成熟度和飽滿度好、角質(zhì)率高、色澤純正的品種容重等級(jí)高［2］。品種的遺傳特性是造成不同類型玉米品種間品質(zhì)差異的主要原因，不同類型玉米品種的粗蛋白、粗脂肪、粗淀粉、賴氨酸含量、籽粒容重及其產(chǎn)量差異達(dá)顯著水平［3］。因此，探討容重的遺傳機(jī)制具有重要意義。

生物的不同性狀之間存在廣泛的表型和生理相關(guān)。Tuberosa等認(rèn)為，QTL分析的手段為闡明性狀間的相關(guān)提供了有用的信息，并提出了性狀相關(guān)可能存在的4 種原因：（1）控制不同性狀的兩個(gè)基因緊密連鎖，分布在染色體的相同或相鄰區(qū)域；（2）同一個(gè)單一功能的基因，對一系列的基因起調(diào)控作用；（3）同一個(gè)基因能獨(dú)立控制兩個(gè)或多個(gè)不同的性狀；（4）兩個(gè)緊密連鎖的基因同時(shí)控制不同的性狀［4］。玉米容重是受多基因控制的數(shù)量性狀，其遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜。近年來，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，有關(guān)玉米穗部性狀的基因定位進(jìn)展也非常迅速，穗部產(chǎn)量性狀、株型性狀等已經(jīng)進(jìn)行多次定位，并獲得大量QTLs，而關(guān)于玉米容重的QTL定位并不多見。彭勃以齊319×黃早四（Q/H）和掖 478×黃早四（Y/H）構(gòu)建的兩個(gè)F2∶3群體為材料，共檢測到18個(gè)加性QTLs，并且包括1個(gè)環(huán)境鈍感型的QTL，這些QTLs分布于第1、3、4、5、7、8、10條染色體上，其中第1條染色體上6個(gè)，第3條1個(gè)，第4條5個(gè)，第5條1個(gè)，第7條1個(gè)，第8條2個(gè)，第10條2個(gè)［5］。本研究以優(yōu)良自交系農(nóng)系531和航天誘變后的農(nóng)系531作親本構(gòu)建F2∶3群體為試驗(yàn)材料，采用SSR分子標(biāo)記構(gòu)建連鎖圖譜，利用完備區(qū)間作圖法（ICIM）對容重進(jìn)行定位，通過對同一材料的加性QTLs和上位性QTLs進(jìn)行檢驗(yàn)、分析，為挖掘控制玉米容重的主效QTL提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以野生型農(nóng)系531（NX531）為母本、航天誘變后的純合農(nóng)系531（M-NX531）為父本構(gòu)建含有163個(gè)家系的F2∶3群體為試驗(yàn)材料。NX531和M-NX531均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)國家玉米改良分中心提供。

1.2 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2010年將未誘變親本NX531與已自交純化的誘變材料M-NX531進(jìn)行夏播，雜交后獲得 F1代植株和F2代種子；同年于海南進(jìn)行加代繁殖F2，F(xiàn)2群體單株嚴(yán)格自交獲得F2∶3群體，以此為材料進(jìn)行覆蓋全基因組、多態(tài)性良好的分子標(biāo)記引物的篩選。2012年在邯鄲農(nóng)科院試驗(yàn)田進(jìn)行F2種子的夏播，對F2單株進(jìn)行嚴(yán)格自交獲得F2∶3群體，共163個(gè)家系，以此為材料進(jìn)行性狀測定并完成QTL定位。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，2次重復(fù)，行長4 m，行寬60 cm，株距25 cm。田間管理標(biāo)準(zhǔn)同普通生產(chǎn)大田一致。

1.3 性狀測定

待玉米果穗成熟后，取中間的連續(xù)5穗收獲，曬干后進(jìn)行室內(nèi)考種，脫粒后用容重器測定容重［6］。對所得數(shù)據(jù)整理后進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，并進(jìn)行方差分析和廣義遺傳力的計(jì)算［7］。廣義遺傳力的計(jì)算公式為：

式中，MSbetweenF2∶3為基因型方差，MSwithinF2∶3為環(huán)境方差，MSt為家系間方差，MSe家系內(nèi)方差。

1.4 SSR分析和QTL分析

在苗期分別剪取P1、P2、F1、F2 單株葉片，采用CTAB法抽提葉片DNA［8］；參照IBM2 2005 Neighbors 2中發(fā)表的SSR分子標(biāo)記（http// www.maizegdb.org），選擇均勻覆蓋玉米全基因組的964對引物，在NX531與M-NX531親本間進(jìn)行親本多態(tài)性的篩選，挑選能夠覆蓋全基因組、多態(tài)性良好的分子標(biāo)記［9-10］，共獲得了親本間多態(tài)性良好的分子標(biāo)記107對，以此進(jìn)行作圖群體標(biāo)記帶型數(shù)據(jù)采集，用于連鎖圖譜的構(gòu)建和各性狀的QTLs分析；以F2單株為作圖群體，用Mapmaker 3.0軟件進(jìn)行連鎖圖譜構(gòu)建［11-12］。

利用QTL IciMapping3.0，采用完備區(qū)間作圖法（ICIM），對玉米容重進(jìn)行QTL加性定位（ICIM-ADD）和QTL上位性定位（ICIMEPI），并確定定位到的QTLs的LOD值，計(jì)算每個(gè)QTL位點(diǎn)的遺傳效應(yīng)及其對表型的貢獻(xiàn)率［13］。

進(jìn)行加性定位時(shí)，確定 L O D的閥值為2.5，作圖函數(shù)采用Kosambi函數(shù)，步長為2.0。加性定位得出結(jié)果后，基因的作用方式按Stuber等的標(biāo)準(zhǔn)判定，DR=顯性效應(yīng)值/ 加性效應(yīng)值，DR= 0～0.20為加性方式，記為A；DR=0.21～0.80為部分顯性，記為PD；DR=0.81～1.20為顯性方式，記為D；DR＞1.20為超顯性方式，記為OD［9］。

進(jìn)行上位性定位時(shí)，確定LOD的閾值為5.0，作圖函數(shù)采用Kosambi函數(shù)，步長為2.0，顯著性水平為0.001［9］。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型數(shù)據(jù)分析

玉米籽粒收獲后進(jìn)行容重測量和數(shù)據(jù)篩選，對其進(jìn)行方差分析，結(jié)果（表1）顯示，組間方差為604.92，組內(nèi)方差為197.29，P值為1.7E-12，可見組間差異極顯著。依照所列公式，計(jì)算F2∶3的廣義遺傳力為50.81%。

表1 表型性狀分析結(jié)果

2.2 組合NX531×M-NX531的遺傳連鎖圖譜

圖1 F2∶3群體遺傳圖譜

選擇均勻分布于玉米10條染色體964對引物，在NX531與M-NX531親本間進(jìn)行親本多態(tài)性的篩選，獲得親本間多態(tài)性良好的分子標(biāo)記107對，進(jìn)行F2分離群體單株基因型的鑒定，最終構(gòu)建出整合了107對SSR引物位點(diǎn)的NX531×M-NX531 的遺傳連鎖圖（圖1）。從圖1可以看出，10條染色體上的107對引物在染色體上的分布如下：第1條染色體的引物數(shù)為34對，第2條和第10條染色體上的引物數(shù)為4對，第3條染色體上引物數(shù)為8對，第4條和第5條染色體上的引物數(shù)為5對，第6條和第7條染色體上的引物數(shù)為12對，第8條染色體上的引物數(shù)為13對，第9條染色體上的引物數(shù)為3對。從第1～10條染色體標(biāo)記間平均距離分別為7.57、5.30、10.83、18.2、10.9、15.66、17.69、11.87、18.33、10.33。染色體長度范圍21.2～257.4 cM，標(biāo)記位點(diǎn)個(gè)數(shù)為3～34個(gè)，總的遺傳長度為1 179.8 cM，約占玉米全基因組的85.76%，標(biāo)記間的平均距離為11.91 cM。

2.3 容重QTL定位加性位置分析

圖2 容重QTL在染色體上的分布及LOD值

利用QTL定位軟件QTL IciMapping3.0，選擇利用完備區(qū)間作圖法（ICIM）作圖，確定以LOD的閥值為2.5，即某位點(diǎn)的LOD≥2.5時(shí)認(rèn)定該位點(diǎn)存在與標(biāo)記連鎖的QTL。對容重加性效應(yīng)進(jìn)行QTL定位的結(jié)果見圖2和表2。由圖2可以得到，玉米10條染色體各位點(diǎn)的LOD值大于2.5的共有3個(gè)，分別位于第1、6、8條染色體上。因此，此次容重QTL加性定位共檢測到3個(gè)QTLs，分別命名為qBD1、qBD2和qBD3。從表2可以看出，qBD1位于Ch1上的bnlg2238和bnlg1866之間，其位點(diǎn)在Ch1的142.0 cM 處，與其上一個(gè)連鎖標(biāo)記bnlg2238的遺傳距離為3.2 cM，與其下一個(gè)連鎖標(biāo)記bnlg1866的遺傳距離為1.8 cM；qBD2位于Ch6上的umc1520和umc1462之間，其位點(diǎn)在Ch7的150.0 cM處，與其上一個(gè)連鎖標(biāo)記umc1520的遺傳距離為13.9 cM，與其下一個(gè)連鎖標(biāo)記umc1462的遺傳距離為12.7 cM；qBD3位于Ch8上的phi080和umc2361之間，其位點(diǎn)在Ch1的24.0 cM處，與其上一個(gè)連鎖標(biāo)記phi080的遺傳距離為17.7 cM ，與其下一個(gè)連鎖標(biāo)記umc251的遺傳距離為14.3 cM。

表2 QTLs位點(diǎn)在染色體上的位置

2.4 容重QTL定位遺傳分析

利用QTL定位軟件QTL IciMapping3.0，對容重上位性效應(yīng)進(jìn)行QTL定位的結(jié)果見表3。從表3可以看出，位于Ch1上的qBD1的LOD閥值為2.79，對表型的貢獻(xiàn)率為6.90%，基因的作用方式為加性，在該位點(diǎn)對加性效應(yīng)增效作用的親本為NX531；位于Ch6上的qBD2的LOD閥值為4.39，對表型的貢獻(xiàn)率為9.24%，基因的作用方式為顯性，在該位點(diǎn)對加性效應(yīng)起增效作用的親本為NX531；位于Ch8上的qBD3的LOD閥值為3.43，對表型的貢獻(xiàn)率為4.15%，基因的作用方式為顯性，在該位點(diǎn)對加性效應(yīng)起增效作用的親本為NX531。

表3 容重的QTL分析結(jié)果

2.5 容重QTL定位上位性分析

利用QTL定位軟件QTL IciMapping3.0，選擇利用完備區(qū)間作圖法（ICIM）作圖，確定以LOD的閥值為5.0，定位結(jié)果如圖3和表4所示。從圖3和表4可以看出，共檢測到3對上位性QTLs，涉及包括第1、3、4、10條共4條染色體的6個(gè)區(qū)段，不存在顯著性位點(diǎn)。按照互作QTL涉及的2個(gè)基因座是否存在顯著效應(yīng)，本試驗(yàn)檢測到的互作QTL只有1種類型，即NN類型（無顯著效應(yīng)基因座與無顯著效應(yīng)基因座之間的互作）共3對，分別為：Ch1上的umc2217-umc1169和Ch3上的bnlg1047-umc2266，最顯著的上位性效應(yīng)為DD，表型貢獻(xiàn)率為14.92%；Ch3上的umc2266-umc2166和Ch4上的umc1808-umc1559，最顯著的上位性效應(yīng)為DD，表型貢獻(xiàn)率為27.34%；Ch3上的umc1229-umc1520和Ch10上的umc2265-dupssr5，最顯著的上位性效應(yīng)為AD，表型貢獻(xiàn)率為24.82%。上位性QTL對容重的遺傳貢獻(xiàn)率范圍為14.92%-27.34%，共解釋67.08%表型遺傳變異。

圖3 容重QTL上位性互作結(jié)果

表4 容重QTL上位性互作結(jié)果

3 討論

在檢測主效QTL 時(shí)，可能會(huì)犯兩類的錯(cuò)誤：第一類是檢測到假陽性QTL，第二類是真實(shí)存在的QTL沒有被檢測到［11］。對于第二類的錯(cuò)誤，一般通過加大分離群體的數(shù)量及提高遺傳圖譜的標(biāo)記密度予以降低；對于第一類的錯(cuò)誤，一般通過界定適當(dāng)?shù)腖OD閾值來予以降低。本試驗(yàn)中，所得遺傳圖譜總長度為1 179.8 cM，約占玉米染色體總長度的85.76%，染色體上的多態(tài)性良好的標(biāo)記為107個(gè)，第1～10條染色體標(biāo)記間平均距離分別為7.57、5.30、10.83、18.2、10.9、15.66、17.69、11.87、18.33、10.33。其中第6、7和9號(hào)染色體上標(biāo)記間的距離較大，易發(fā)生第二類錯(cuò)誤，漏掉真實(shí)存在的標(biāo)記；其余染色體標(biāo)記距離較近，減少了第二類錯(cuò)誤的概率。但本試驗(yàn)中確定的LOD=2.5較經(jīng)驗(yàn)值3.0偏小，可能因此造成檢測到假陽性的QTL。

本試驗(yàn)中，在qBD1、qBD2、qBD3等3個(gè)位點(diǎn)起增效作用的親本均為NX531。但以往的眾多QTL定位試驗(yàn)已證明，對相同性狀的不同的QTL位點(diǎn)起增效作用的可能是雙親中的任何一個(gè)。由于增效等位基因可能同時(shí)來自雙親，所以在聚合創(chuàng)制優(yōu)良育種新材料時(shí)，雙親材料的遺傳貢獻(xiàn)均應(yīng)當(dāng)引起重視［14］。Song等［11］將這種親本的增效作用稱為隱蔽基因效應(yīng)（cryptic gene effect），認(rèn)為某些等位基因在親本中被緊密連鎖的其它基因所隱蓋，發(fā)生重組后可被檢測到［15］。

目前國內(nèi)關(guān)于玉米容重QTL定位的試驗(yàn)報(bào)道尚不多見，因此定位到的QTL數(shù)量很少［16-17］。彭勃［5］對容重進(jìn)行QTL定位，在不同試驗(yàn)地區(qū)共檢測到18個(gè)QTL位點(diǎn)，其中位于Ch1上的位點(diǎn)位置分別為148、180、214、234、236、410 cM，位于Ch8上的位點(diǎn)位置分別為134和0cM，沒有位于Ch6上的位點(diǎn)。而本試驗(yàn)檢測出的3個(gè)QTLs分別位于Ch1的142.00 cM處、Ch6的150.00 cM處和Ch8的24.00 cM處。許理文等［18］利用先玉335的DH系群體和SNP標(biāo)記定位玉米容重QTL，在不同年份和地點(diǎn)定位到5個(gè)QTL位點(diǎn)分布在第1、4、8、9號(hào)染色體上。許蒙蒙等［19］利用農(nóng)大108的RIL群體定位了動(dòng)態(tài)的玉米容重QTL，本試驗(yàn)中位于Ch1上142.00 cM處的位點(diǎn)與彭勃［5］位于148 cM處的位點(diǎn)接近，可看做相同QTLs。因此，本試驗(yàn)與前人試驗(yàn)檢測到一個(gè)相同位點(diǎn)，其余的位點(diǎn)均為新發(fā)現(xiàn)標(biāo)記。

本試驗(yàn)中3個(gè)位點(diǎn)的基因作用方式分別為A、D、D，而前人研究結(jié)果指出容重的性狀遺傳力較高，主要受加性效應(yīng)控制［17-18］。

存在不同位點(diǎn)和不同基因作用方式現(xiàn)象的原因可能包括：（1）不同的親本組配出的不同群體在基因型上存在較大差別；（2）QTL易受環(huán)境條件的影響，表現(xiàn)不穩(wěn)定；（3）試驗(yàn)中大多數(shù)QTL定位的平均分子標(biāo)記密度都在10 cM以上，因此定位精度不高；（4）檢測過程中假陽性標(biāo)記和真實(shí)存在的卻未被檢測到的標(biāo)記偏多會(huì)造成位點(diǎn)錯(cuò)開。

上位性在復(fù)雜數(shù)量性狀的遺傳和雜種優(yōu)勢的形成中起著重要的作用。上位性在不同性狀之間的互作位點(diǎn)、作用方式不盡相同，但其在玉米穗部性狀中普遍存在，是不能被忽略的，在遺傳中可能有著與玉米主效QTL同樣重要的作用［20］。在本研究中，本群體檢測到3對上位性QTL，這3對上位性互作QTLs為非顯著QTL位點(diǎn)間的互作，即當(dāng)這些上位性QTLs單獨(dú)存在時(shí)，對表型性狀的作用很小，只有與其他位點(diǎn)發(fā)生互作時(shí)才能影響表型性狀。這也說明除了加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)外，上位性效應(yīng)也是容重的重要遺傳基礎(chǔ)。

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