康萍芝，張麗榮，杜玉寧，白小軍，張治科

（寧夏農(nóng)林科學(xué)院植物保護研究所/寧夏植物病蟲害防治重點實驗室，寧夏 銀川 750002）

寧夏中部干旱帶壓砂西瓜地多年來由于壓砂地嚴(yán)重缺水、輪作困難而連茬種植，加之生產(chǎn)上長期和大量使用化肥和化學(xué)農(nóng)藥，導(dǎo)致壓砂地肥力衰退、土壤老化、鹽堿化、產(chǎn)品品質(zhì)明顯下降、枯萎病等土傳病害和連作障礙等問題非常嚴(yán)重，使壓砂瓜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)和健康發(fā)展面臨著嚴(yán)峻的考驗和挑戰(zhàn)。

生產(chǎn)中輪作、培育抗病品種、砧木嫁接等非化學(xué)防控措施經(jīng)常被推薦用于控制枯萎病等土傳病害，這些技術(shù)措施雖然效果明顯，但由于自身存在著某些缺點導(dǎo)致在生產(chǎn)中難以實施或大面積推廣應(yīng)用，而施用生物有機肥目前被認(rèn)為是一種可持續(xù)的生物防控土傳病害的新途徑。許多研究表明，生物有機肥除了有促進作物生長、提高產(chǎn)量［1-3］和改善品質(zhì)的作用外［4-9］，還有減少和緩解因連作而導(dǎo)致的土傳病害的作用［10-13］。本試驗以壓砂西瓜枯萎病為靶標(biāo)對象，采用室內(nèi)稀釋平板涂抹法、Biolog-ECO微平板法和田間穴施方法，探討了施用生物有機肥對壓砂西瓜的促生長作用、枯萎病的防控效果及對土壤微生物區(qū)系和群落功能多樣性的影響，篩選出了防控壓砂西瓜枯萎病或減輕連作障礙的生物有機肥最佳用量和有效方法，為解決我區(qū)壓砂瓜連作障礙瓶頸問題提供重要的理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試肥料：馕播王復(fù)合微生物肥或生物有機肥（江蘇省江陰市聯(lián)業(yè)生物科技有限公司生產(chǎn)）有效活菌數(shù)（CFU）≥0.20億/g、有機質(zhì)（以干基計）≥40.0%、游離氨基酸（以干基計）≥0.70%、總養(yǎng)分（以干基計）10%～15%、pH 5.5～8.5；金菌冠微生物菌劑（山東金正大生態(tài)工程集團股份有限公司生產(chǎn)）有效活菌數(shù)≥5.0億/g、有機質(zhì)≥45.0%，特別添加黃腐酸鉀。

供試作物為壓砂西瓜，品種為金城五號。

供試土壤為連作12年的老壓砂西瓜地，土壤肥力差。土壤理化性狀為：pH值8.0、全鹽0.66 g/kg、有機質(zhì)5.22 g/kg、全量氮0.39 g/kg、全量磷0.51 g/kg、全量鉀22.9 mg/kg、速效氮80 mg/kg、速效磷8.12 mg/kg、速效鉀132 mg/kg。

供試培養(yǎng)基均使用選擇性培養(yǎng)基，分離培養(yǎng)細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、真菌用馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基、放線菌用改良高氏1號培養(yǎng)基、尖孢鐮刀菌使用Komada選擇性培養(yǎng)基測定。

主要儀器設(shè)備：立式電熱蒸汽壓力滅菌鍋；干燥箱；空氣浴培養(yǎng)搖床；超凈工作臺；霉菌培養(yǎng)箱；電子天平等儀器設(shè)備。

1.2 試驗方法

試驗于2016年在寧夏中衛(wèi)市香山鄉(xiāng)紅圈子村三合隊進行，選擇連作12年的西瓜壓砂地進行田間試驗，試驗設(shè)馕播王生物有機肥100、200、300、400 g/穴和金菌冠微生物菌劑100 g/穴、單施基質(zhì)200 g/穴（處理1～處理6）及常規(guī)種植施肥（CK）7個處理，每個處理3次重復(fù)，試驗地種植管理水平和條件相同。

施肥采用穴施方法，先挖20 cm×30～50 cm×20～30 cm的坑穴，再將馕播王生物有機肥撒入坑內(nèi)與土拌勻，盡可能往下翻至30 cm，然后覆土覆砂。

采用五點取樣法，分別對不同處理壓砂瓜根圍土壤進行取樣，挖開砂采集土壤深度為0～15 cm，將不同位點的土樣混勻后裝入保鮮袋內(nèi)密閉，帶回試驗室內(nèi)進行土壤微生物種類分離和數(shù)量測定。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 生長指標(biāo)和產(chǎn)量測定 施肥后于生育期內(nèi)使用卷尺和游標(biāo)卡尺測定壓砂西瓜主蔓長、莖粗、葉片數(shù)等生長指標(biāo)，每個處理測定株數(shù)為30株；收獲期測定整個試驗小區(qū)的產(chǎn)量，并計算其增產(chǎn)效果。

1.3.2 病害發(fā)生情況調(diào)查 重點調(diào)查整個試驗小區(qū)壓砂西瓜生育期內(nèi)的死苗、枯萎病發(fā)生情況，并計算其死苗率、病株率和相對防效。

1.3.3 土壤樣品理化性狀測定 測定指標(biāo)包括土壤pH值、有機質(zhì)、全鹽、全量氮、全量磷、全鉀、速效氮、速效磷、速效鉀等。其中，土壤 pH值測定采用酸度計；全鹽測定采用電導(dǎo)率法；有機質(zhì)測定采用重鉻酸鉀滴定法；全量氮測定采用凱氏定氮法；速效氮測定采用擴散吸收法；全量磷、速效磷測定采用分光光度計法；全鉀測定采用原子吸收分光光度法；速效鉀測定采用火焰光度法。

1.3.4 土壤微生物區(qū)系及病原菌數(shù)量測定 采用平板涂抹法。土壤懸液制備及分離方法：取10 g西瓜根部土壤樣品，倒入裝有100 mL滅菌水的150 mL三角瓶中，放入搖床上振蕩15min后靜置，再稀釋成102、103、104、105、106倍的土壤懸液，取0.2 mL加入到已凝固的選擇性培養(yǎng)基平板上涂抹均勻，然后置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d左右，觀察菌落出現(xiàn)情況，分別調(diào)查土壤中細(xì)菌、真菌、放線菌及尖孢鐮刀菌的數(shù)量。細(xì)菌使用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基；真菌用馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基；放線菌用改良高氏1號培養(yǎng)基；西瓜枯萎病菌（尖孢鐮刀菌）采用Komada選擇性培養(yǎng)基。

1.3.5 土壤微生物群落功能多樣性測定 采用Biolog-ECO微平板法。稱取10 g鮮土（稱量前測量含水量），加入90 mL無菌生理鹽水中稀釋，在搖床里振搖30 min，靜止沉淀3～5 min，然后進行100倍稀釋，以每孔150 μL稀釋液加入微孔板中，將制備好的菌懸液倒入無菌移液槽中，使用八孔移液器將其接種于微平板的96孔中。接種好的微平板放到鋪有六層紗布的塑料盒中，為防止微平板鑒定孔中的菌懸液揮發(fā)，紗布保持一定的濕度。塑料盒用保鮮膜包裹，保鮮膜上用注射針頭扎若干個小眼，以保證微生物的培養(yǎng)所需要的氧氣，將微平板避光培養(yǎng)。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

使用Excel 2003和SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理，利用 Duncan's 法進行數(shù)據(jù)方差分析；采用Biolog微平板培養(yǎng)96h的數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，利用Excel和 DPSv3.11、CANOCO軟件對ECO板結(jié)果進行統(tǒng)計分析?？椎钠骄伾兓剩ˋWCD）計算方法如下：

式中，C為處理每個碳源孔的光密度值；R為對照孔的光密度值；n為培養(yǎng)基碳源種類數(shù)。

通過豐富度、多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)和優(yōu)勢度指數(shù)等來表征土壤微生物群落的功能多樣性，并分析其差異顯著性；將BiologGN2微平板中的氨基酸類、糖類、羧酸類、聚合物類和多種碳源等物質(zhì)進行主成分分析（PCA），以便了解土壤微生物的主要類群。

2 結(jié)果與分析

2.1 穴施生物有機肥對壓砂西瓜生長指標(biāo)、產(chǎn)量的影響及枯萎病防效測定

從表1、表2可以看出，單施不同用量生物有機肥對西瓜有明顯促生長作用，與金菌冠微生物菌劑、常規(guī)施肥（CK）相比，各處理西瓜死苗率有所降低，主蔓長、葉片數(shù)、分枝數(shù)、莖粗均顯示出明顯優(yōu)勢，差異顯著，對枯萎病的防效達77.21%～88.73%，增產(chǎn)率達14.7%～26.8%，其中處理2、處理3、處理4效果比較明顯，產(chǎn)量差異顯著，防效高。

表1 穴施生物有機肥對壓砂西瓜死苗率、生長指標(biāo)及枯萎病防控的影響

表2 穴施生物有機肥對壓砂西瓜產(chǎn)量的影響

圖1 生物有機肥對壓砂西瓜土壤微生物區(qū)系及尖孢鐮刀菌數(shù)量的影響

2.2 穴施生物有機肥對壓砂西瓜土壤微生物區(qū)系及尖孢鐮刀菌數(shù)量的影響

試驗結(jié)果（圖1）表明，施以不同用量的生物有機肥后，壓砂地土壤微生物區(qū)系發(fā)生不同程度變化，其中真菌數(shù)量處于先下降后緩慢上升趨勢，細(xì)菌、放線菌呈上升趨勢，尖孢鐮刀菌呈下降趨勢，且各施肥處理均好于對照生物菌肥、單施基質(zhì)和常規(guī)對照，尤其是金菌冠微生物菌劑處理效果較差。

2.3 穴施生物有機肥對壓砂西瓜土壤微生物群落功能多樣性的影響

采用Biolog方法進行單施生物有機肥對土壤微生物群落功能多樣性的影響測定。結(jié)果表明：隨著培養(yǎng)時間的延長，施用生物有機肥處理后，壓砂西瓜土壤微生物群落利用全部碳源和羧酸類、碳水化合物、氨基酸、羧酸等6種碳源總體呈上升趨勢，其中處理1～處理4高于CK，而處理5、處理6低于CK（圖2、圖3），說明施用生物有機肥后土壤微生物群落對全部碳源的利用能力較高，微生物代謝活性較強；不同處理對土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)的影響也存在一定的差異性（表3），物種豐富度、優(yōu)勢度指數(shù)、多樣性指數(shù)均有所上升；從樣品主成分分析的散布區(qū)域（圖4）可以看出，處理2～處理4處于同一區(qū)域內(nèi)分布相對集中，相似度較高，對碳源的利用能力比較強，而其余處理土壤樣品分布差異較大。

圖2 不同處理對壓砂西瓜土壤微生物利用全部碳源的AWCD值

圖3 不同處理對壓砂西瓜土壤微生物利用6種不同碳源的AWCD值

表3 不同處理土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)

3 結(jié)論與討論

西瓜枯萎病是西瓜生產(chǎn)中較難防治的一種土傳病害。多年來，國內(nèi)外許多專家學(xué)者都在尋找防控西瓜枯萎病的有效途徑，而生物有機肥以其獨特的優(yōu)勢成為目前生物防治研究的熱門和安全、環(huán)保的生防措施。本研究通過兩年的田間多點試驗，篩選出了有效防控壓砂西瓜枯萎病或減輕連作障礙的生物有機肥最佳用量，建議連作10年左右的老砂地，西瓜苗根部穴施生物有機肥適宜用量為200～300 g/穴；而連作5年左右的新砂地，西瓜苗根部穴施生物有機肥適宜用量為140～200 g/穴；若在坑內(nèi)苗旁施用生物有機肥，可加大用量至400 g/穴。

圖4 不同處理土壤微生物群落功能多樣性主成分分析

同時，研究結(jié)果也表明，施用生物有機肥可顯著提高壓砂西瓜根部土壤有益微生物的數(shù)量，且對壓砂西瓜植株具有明顯的促生長作用和防病效果。本試驗施用不同用量的生物有機肥后，土壤中細(xì)菌和放線菌的數(shù)量顯著增加，尖孢鐮刀菌數(shù)量顯著減少，真菌數(shù)量先減少后緩慢增加，且施肥量越大，效果越明顯；施用生物有機肥還可對壓砂西瓜產(chǎn)生明顯的促生長作用，這一結(jié)果與凌寧等［14］的研究結(jié)果相似。另外，施用生物有機肥也對西瓜枯萎病具有一定的防控效果，具體表現(xiàn)為可延遲西瓜發(fā)病時間，病株率降低，提早成熟期7～10 d，且隨著生物有機肥施用量的增加，防病效果越好。

土壤微生物區(qū)系失去平衡是作物連作產(chǎn)生障礙的主要因素之一。因此，在研究克服連作障礙的施肥過程中，不僅要抑制土傳病原菌的數(shù)量，而且要提高有益細(xì)菌和放線菌的數(shù)量［15－16］。本試驗結(jié)果表明，施用生物有機肥可以明顯增加壓砂西瓜根部土壤細(xì)菌、放線菌數(shù)量，大大降低尖孢鐮刀菌的數(shù)量，使土壤微生物區(qū)系朝著有利的方向發(fā)展。分析其原因，主要是生物有機肥中的有益菌群可直接帶入或刺激產(chǎn)生大量的有益微生物，而生物有機肥中添加的解淀粉芽孢桿菌、木霉等拮抗菌及其代謝產(chǎn)物通過競爭、重寄生、抗生等作用可抑制土壤中尖孢鐮刀菌的生長，降低病原菌數(shù)量，有利地調(diào)節(jié)土壤微生態(tài)環(huán)境，從而減輕壓砂西瓜枯萎病等土傳病害的發(fā)生。

此外，本研究通過常規(guī)微生物平板計數(shù)和Biolog技術(shù)相結(jié)合的研究方法，能夠較為真實地反映出壓砂西瓜根部土壤中微生物種群數(shù)量和功能結(jié)構(gòu)多樣性所發(fā)生的變化，為壓砂瓜枯萎病等土傳病害的有效生物防治和連作障礙機理的研究提供重要的理論和實踐依據(jù)。

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