劉倩倩，李彩霞，趙 靜，谷從璟，張曉東

（玉溪師范學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院，云南 玉溪 653100）

香葉醇是一種非環(huán)式單萜醇，廣泛應(yīng)用于香精香料工業(yè)［1-5］。此外，香葉醇也是大部分藥用植物、香料植物產(chǎn)生香味的主要化學(xué)成分［6］，除了用于日用化學(xué)品、卷煙和食品加工等領(lǐng)域［7］，還可用作驅(qū)蟲劑、抗菌劑、抗腫瘤劑和汽油替代品［5，7-8］，市場供不應(yīng)求。目前，香葉醇主要通過植物提取和化學(xué)合成手段生產(chǎn)。由于天然植物香葉醇含量低，化學(xué)合成的原料為化工產(chǎn)品不可再生且易導(dǎo)致環(huán)境污染，使用現(xiàn)代生物技術(shù)手段生產(chǎn)香葉醇具有非常好的前景。因此，需要對香葉醇生物合成途徑關(guān)鍵基因進行克隆和功能研究。

隨著基因克隆和DNA測序技術(shù)的迅速發(fā)展，香葉醇生物合成途徑相關(guān)基因相繼被發(fā)現(xiàn)和克隆。香葉醇合成酶基因是香葉醇生物合成途徑的主要基因之一。研究表明，香葉醇合成酶（GES，EC 3.1.7.3）能夠催化香葉基焦磷酸（GPP）生成香葉醇，是單萜生物合成途徑的限速酶［9-11］。在植物中，起初人們認(rèn)為從GPP到香葉醇的反應(yīng)是由磷酸酶或單萜合成酶催化的。在羅勒中，ObGES基因的分離，為單萜合成酶參與精油重要成分香葉醇的合成提供了首個證據(jù)［11］。接下來，在精油中能夠累積香葉醇的細毛樟［12］、纈草［13］、甜蛇草［13］、藿香［6］和紫蘇［14］等植物中，分離和鑒定了其中的GES基因。Dong等［13］分別從纈草和甜草中分離出VoGES和LdGES基因，在大腸桿菌中表達后，酶活分析結(jié)果表明其對底物GPP的Km分別為32、51μmol/L；GFP融合試驗結(jié)果表明VoGES主要定位于質(zhì)體，而LdGES分別定位于質(zhì)體與細胞質(zhì)。將長春花CrGES基因在大腸桿菌中過表達，其純化蛋白能夠催化GPP生成香葉醇，Km為58.5μmol/L；CrGES基因在葉和芽中特異性表達，并且其表達被茉莉酸甲酯（JA）誘導(dǎo)［9，11］。在結(jié)構(gòu)方面，Sato等［1］研究發(fā)現(xiàn)，紫蘇香葉醇合酶結(jié)構(gòu)域IV-1和IV-4對香葉醇的形成非常重要，結(jié)構(gòu)域IV-4中的5個氨基酸通過定位正電荷在碳陽離子中間體的分布，來決定羥基引入的位置。

在基因工程方面，普遍采用大腸桿菌、模式植物和酵母來生產(chǎn)香葉醇。使用大腸桿菌生產(chǎn)香葉醇中，ObGES是一個代謝調(diào)節(jié)閥［15］。Chen等［10］將喜樹去除葉綠體轉(zhuǎn)運肽的tCaGES和FPPS在大腸桿菌中表達，通過優(yōu)化培養(yǎng)基組成、發(fā)酵時間和添加重金屬離子等條件，可使香葉醇產(chǎn)量達到48.5（±0.9）mg/L。Liu等［3］在大腸桿菌BL21中過表達羅勒（Ocimum basilicum）香葉醇合酶基因ObGES、巨冷杉（Abies grandis）AgGPPS和一個異源甲羥戊酸途徑，使用補料分批發(fā)酵方式，使香葉醇產(chǎn)量達到78.8 mg/L；使用水-有機雙相發(fā)酵系統(tǒng)，通過?；D(zhuǎn)移酶處理，最終獲得2.0 g/L香葉醇的產(chǎn)量，這是迄今已報道的最高產(chǎn)量。Fischer等［16］分別將ObGES基因轉(zhuǎn)化葡萄、煙草、擬南芥和細菌，結(jié)果香葉醇產(chǎn)量分別為煙草＞葡萄＞擬南芥＞細菌，均遠低于ObGES基因在酵母中的產(chǎn)量499（±188）μg/g鮮重，表明香葉醇合酶的功能特性不僅取決于其氨基酸序列，也取決于表達細胞的背景。Ritala等［17］通過將纈草質(zhì)體定位的VoGES基因轉(zhuǎn)入煙草毛根中來生產(chǎn)香葉醇，結(jié)果表明游離香葉醇含量高達31.3 μg/g干重，香葉醇衍生物主要包含己糖和戊糖香葉醇結(jié)合物、羥化香葉醇等6種形式，脫糖反應(yīng)后香葉醇含量高達204.3 μg/g干重。Liu等［18］將密碼子優(yōu)化的羅勒ObGES基因整合到酵母基因組中，產(chǎn)量達到0.93 mg/L。Jiang等［5］通過基因篩選、截短CrGES蛋白N端的轉(zhuǎn)運肽、在酵母中共表達截短的CrGES和FPPS方法，采用分批補料發(fā)酵技術(shù)，使香葉醇產(chǎn)量達到1.68 g/L。Zhao等［5］則通過在酵母LEU2原養(yǎng)型菌株中刪除OYE2（編碼NADPH氧化還原酶）、動態(tài)調(diào)控ERG20的表達、使用乙醇進行補料分批發(fā)酵，使香葉醇產(chǎn)量達到1.69 g/L，是目前已報道酵母的最高產(chǎn)量。

滇龍膽（Gentiana rigescens）是云南道地藥材，主要用于治療肝炎和膽囊炎［19-21］。目前，滇龍膽是龍膽瀉肝片、苦膽草片和小兒清熱片等200多種中藥的主要原料［22］。本研究以滇龍膽為材料，利用RT-PCR技術(shù)成功地克隆了香葉醇合酶基因，對其編碼蛋白基因功能進行預(yù)測，進行原核表達，并采用熒光定量PCR方法分析該基因在根和葉中的表達，為下一步研究其在香葉醇及滇龍膽藥效成分龍膽苦苷合成中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

滇龍膽植物材料、主要藥品試劑和儀器同文獻［23］，采樣日期為2016年5月15日。

1.2 試驗方法

1.2.1 滇龍膽RNA提取和基因克隆 滇龍膽RNA的提取和基因克隆步驟參照張玲等［23］的方法，GrGES基因特異引物見表1。以cDNA為模板進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分離、膠回收、末端加A、連接到pMD19T載體，獲得重組載體pMD19-GrGES。

1.2.2GrGES基因及其編碼蛋白的生物信息學(xué)分析 采用張玲等［23］的方法對GrGES基因及其編碼蛋白進行序列分析。

表1 GrGES基因克隆和熒光定量分析的引物序列

1.2.3 原核表達載體的構(gòu)建 使用限制酶BamHI和SalI，分別對已測序質(zhì)粒pMD19-GrGES和載體pET32a進行雙酶切，然后分別回收目的基因和載體片段，按4∶1（摩爾比）的比例連接過夜，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.ColiDH5α，涂布于氨芐青霉素（100 mg/L）+IPTG（24 mg/L）+ X-gal（20 mg/L）的LB固體平板，37℃過夜培養(yǎng)后挑取陽性菌落；搖菌、提質(zhì)粒，通過酶切檢測大小正確后，進行DNA測序，最終獲得原核表達載體pET32a-GrGES。

1.2.4GrGES基因原核表達 采用42℃熱激法將pET32a-GrGES重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.ColiRosetta（DE3）表達菌感受態(tài)細胞，挑單菌落于含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)。次日以1∶100（菌種∶培養(yǎng)基）比例接種到新鮮的LB液體培養(yǎng)基（不含抗生素）中，37℃搖床培養(yǎng)3 h，然后在37℃、1 mmol/L IPTG的誘導(dǎo)下進行表達，以同條件下空載體pET32a轉(zhuǎn)化菌做對照；分別誘導(dǎo)0、2、4和6 h后，超凈臺中取2 mL。4℃離心1 min集菌，倒掉上清，加超純水100 μL、5 × 蛋白上樣緩沖液25 μL，振蕩懸菌，100℃煮5 min裂解菌體。4℃、12 000 r/min離心10 min。取20 μL樣品進行上樣，然后進行SDS-PAGE（5%濃縮膠和12%分離膠）電泳檢測。

1.2.5 滇龍膽GrGES基因的實時熒光定量表達分析 滇龍膽GrGES基因的組織特異性表達分析參考張玲等［23］的方法，對三年生滇龍膽的根和葉進行采樣、RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄，然后進行qPCR反應(yīng)。選擇滇龍膽GrGAPDH基因作為內(nèi)參基因。qPCR引物見表1。定量數(shù)據(jù)采用比較Ct值的2-△△Ct法進行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 滇龍膽GrGES基因的克隆

使用GrGES基因特異性引物和滇龍膽幼葉的第一鏈cDNA模板進行PCR反應(yīng)，擴增出大約2 000 bp的DNA片段（圖1）。通過TA克隆、酶切檢測和DNA測序方法，獲得正確的重組質(zhì)粒pMD19-GrGES。

2.2 GrGES基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1GrGES基因序列分析 將GrGES基因測序結(jié)果提交GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得序列登錄號KJ917168。利用Genetyx軟件對GrGES基因進行序列分析，結(jié)果表明該基因長1 767 bp，共編碼588個氨基酸，這與長春花CrGES基因大小類似［9］。

圖1 滇龍膽GrGES基因的PCR擴增結(jié)果

圖2 滇龍膽GrGES蛋白與其他藥用植物GES蛋白的多序列比對分析

利用Gen Bank數(shù)據(jù)庫蛋白比對程序BLASTp對GrGES蛋白進行比對分析，結(jié)果表明滇龍膽GrGES與長春花CrGES蛋白序列相似性最高（70.65%），與楊樹PtGES（45.12%）蛋白相似性相對較低。選擇與GrGES蛋白相似性較高的序列，采用DNAMAN 8進行多序列比對分析，結(jié)果（圖2）表明，GrGES蛋白與已知GES蛋白序列具有較高保守性。利用MEGA7.0.26將GrGES氨基酸序列與BLASTp中相似性較高的長春花（Catharanthus roseus，AFD64744.1）、纈草（Valeriana officinalis，AGB05612.1，AGB05613.1，AHE41084.1）、油橄欖（Olea europaea，AFI47926.1）、芝麻（Sesamum indicum，XP_011080637.1）、桂花（Osmanthus fragrans，AMB57285.1）、甜舌草（Phyla dulcis，ADK62524.1）胡黃連（Picrorhiza kurrooa，AHX97739.1）、喜樹（Camptotheca acuminata，ALL56347.1）、羅勒（Ocimum basilicum，Q6USK1.1）、葡萄（Vitis vinifera，NP_001267920.1）、楊樹（Populus trichocarpa，AEI52903.1）等11種植物的GES蛋白序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果（圖3）顯示，滇龍膽GrGES蛋白與長春花CrGES聚為同一進化枝，表明二者親緣關(guān)系很近，GrGES蛋白參與萜類生物堿龍膽苦苷生物合成途徑。

圖3 滇龍膽GrGES蛋白與其他植物GES蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

圖4 滇龍膽GrGES蛋白的疏水性分析

2.2.2 GrGES蛋白的理化特性分析 使用ProtParam工具對GrGES蛋白進行分析，結(jié)果表明GrGES蛋白單體相對分子量為67.84 ku，pI為5.56，與長春花CrGES蛋白類似［9］；帶負電氨基酸殘基（Asp + Glu）為83，帶正電氨基酸殘基（Arg + Lys）為68，化學(xué)方程式為：C3031H4778N806O894S32。不穩(wěn)定指數(shù)為55.21，屬不穩(wěn)定蛋白；脂肪指數(shù)92.06，總平均疏水性（GRAVY）-0.29，為親水蛋白（圖4）。GrGES蛋白包含20種基本氨基酸，其中亮氨酸含量最高（12.80%）；其次是谷氨酸和絲氨酸（9.50%和8.00%）；半胱氨酸含量最低（1.40%）。

2.2.3 GrGES蛋白二級和三級結(jié)構(gòu)分析 利用Predictprotein對GrGES蛋白進行二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果表明該蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占62.41%，環(huán)占39.57%，延伸帶占0.68%；暴露于外部的蛋白占31.63%，被包埋的蛋白占59.18%，介于二者的中間部分占9.18%。利用Swiss-Model Workspace軟件自動模式對GrGES蛋白的三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果如圖5所示。該3D模型以灰楊（Populus×canescens）異戊二烯合酶［3n0f.1］為模板，在第106～573氨基酸處建模，序列相似性為44.28%。

2.2.4 GrGES蛋白結(jié)構(gòu)域分析 使用InterPro在線軟件對GrGES蛋白保守結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測，結(jié)果顯示GrGES蛋白具有其他植物GES蛋白萜類環(huán)化酶的活性位點（底物結(jié)合口袋cd00684，305R、314W、335I、337I、338L、339L、342D、346D、417F、484R、485L、487D、488D、491T、 495E、564Y、569D、571Y）、金屬結(jié)合位點，包含2個保守結(jié)構(gòu)域（圖6），分別為萜類合酶N端結(jié)構(gòu)域（IPR001906，81～273）和萜類合酶結(jié)構(gòu)域（IPR005630，263～588）。

圖5 滇龍膽GrGES蛋白的3D結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖6 滇龍膽GrGES蛋白保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測

2.2.5 GrGES蛋白信號肽預(yù)測 使用SignalP 4.1對GrGES蛋白信號肽進行預(yù)測，未發(fā)現(xiàn)信號肽，表明該蛋白為非分泌型蛋白。采用ChloroP v1.1對GrGES蛋白葉綠體轉(zhuǎn)運肽進行分析，結(jié)果顯示GrGES蛋白含有1個葉綠體轉(zhuǎn)運肽，長度為44個氨基酸。利用TMHMM對GrGES蛋白跨膜螺旋區(qū)進行預(yù)測，結(jié)果（圖7）顯示GrGES蛋白不含有跨膜區(qū)域。

圖7 滇龍膽GrGES蛋白可能跨膜螺旋的檢測

2.2.6 GrGES蛋白亞細胞定位預(yù)測 使用WoLF PSORT對GrGES蛋白進行亞細胞定位預(yù)測，結(jié)果顯示GrGES蛋白在葉綠體和細胞質(zhì)中的定位系數(shù)分別為12.0和2.0，表明該蛋白定位于葉綠體。

2.2.7GrGES基因稀有密碼子分析 使用在線軟件對GrGES基因稀有密碼子進行預(yù)測，結(jié)果顯示該基因中稀有密碼子為1.70%，僅含有1個二聯(lián)稀有密碼子，因此可采用E.coli表達菌Rosetta（DE3）進行原核表達。

2.3 GrGES基因原核表達載體的構(gòu)建

使用快切酶BamHI和SalI雙酶切檢測重組質(zhì)粒pET32a-GrGES，可切出載體和目的基因（圖8），表明GrGES基因已成功插入載體pET32a。對酶切檢測正確的質(zhì)粒，進行DNA測序，表明未出現(xiàn)移碼現(xiàn)象。

圖8 質(zhì)粒pET32a-GrGES雙酶切檢測

2.4 GrGES基因的原核表達

將重組質(zhì)粒pET32a-GrGES轉(zhuǎn)化E.ColiRosetta（DE3）后，在37℃、1 mmol/L IPTG下，分別誘導(dǎo)表達0、2、4、6 h，然后提取細菌總蛋白，進行SDS-PAGE分析。結(jié)果（圖9）表明，與對照（第1～3泳道）相比，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，轉(zhuǎn)化菌pET32a-GrGES在相對分子質(zhì)量78.22 ku（含Trx、S·Tag、His·Tag等標(biāo)簽蛋白約17.71 ku）左右出現(xiàn)一蛋白條帶，且GrGES融合蛋白表達量隨誘導(dǎo)時間增加而逐漸增加，這表明pET32a-GrGES重組質(zhì)粒在E.ColiRosetta（DE3）中已成功誘導(dǎo)表達出GrGES蛋白。

圖9 37℃下不同誘導(dǎo)時間對GrGES蛋白表達的影響

2.5 GrGES基因的組織特異性表達分析

取三年生盆栽滇龍膽的根和葉，分別提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA后，通過實時熒光定量RT-PCR分析GrGES基因在根和葉中的表達情況。結(jié)果表明，GrGES基因在葉中表達量很高，約是根的3 000倍。

3 結(jié)論與討論

香葉醇合酶能夠催化GPP合成香葉醇，其編碼基因已從長春花［9］、纈草［17］、喜樹［10］等許多植物中被克隆和研究，但是植物次生代謝具有很強的種屬特異性，模式植物中所獲得的結(jié)果往往不具有普遍性，因此需要對不同植物基因進行研究［24］。本研究從滇龍膽中成功克隆到GrGES基因，其編碼蛋白GrGES包含一個高度保守的富含天冬氨酸的基序DDIFD和另一個高度保守的NSE/DTE基序（保守序列為LWDDLGTAKEE）（圖2）。大多數(shù)植物GES蛋白均包含這兩種基序，主要功能為參與焦磷酸底物的結(jié)合與依賴金屬離子的離子化［10］，這表明本研究所克隆的基因為GES基因。存在于許多植物中的N末端RRX8W基序主要參與GES蛋白的質(zhì)體定位，在轉(zhuǎn)運到質(zhì)體后會被切除［10］，但是，在GrGES中并未發(fā)現(xiàn)該基序。由于GrGES蛋白氨基酸疏水性的特征，使用WoLF PSORT軟件對GrGES蛋白進行亞細胞定位預(yù)測時，該蛋白定位于葉綠體，使用ChloroP v1.1軟件對GrGES蛋白葉綠體轉(zhuǎn)運肽進行預(yù)測，結(jié)果也顯示GrGES蛋白含有一個44個氨基酸組成的葉綠體轉(zhuǎn)運肽。這與纈草VoGES蛋白和長春花CrGES蛋白的亞細胞定位一致［9，17］，與甜舌草LdGES蛋白定位于葉綠體和細胞質(zhì)不同［13］。

基因的組織表達特異性決定了其代謝產(chǎn)物的組織特異性。在長春花中，CrGES基因主要在葉和芽中特異性表達，并且其表達能夠被茉莉酸甲酯誘導(dǎo)［11］。本研究中，GrGES基因在葉中表達量遠遠高于根中，說明香葉醇的生物合成主要在葉中進行。本研究為香葉醇的生物合成及滇龍膽分子生物學(xué)研究提供基因資源，并為GrGES蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究奠定基礎(chǔ)。

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