姜 穎，張麗娜，潘冬梅，韓承偉，王曉楠，曹 焜，韓喜財，孫宇峰

（1.黑龍江省科學院大慶分院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學，黑龍江 大慶 163319）

大麻（Cannabis sativaL.）為大麻科（Cannabinaceae）大麻屬（CannabisL.）一年生草本植物［1-2］，在我國已有 5 000多年的栽培利用歷史，是我國傳統(tǒng)經(jīng)濟作物，具有重要的工業(yè)及藥用價值［3-4］。采用歐盟的劃分標準即THC＜0.3%為無毒大麻即工業(yè)大麻，世界各國都只允許種植工業(yè)大麻。大麻的產(chǎn)品利用涉及紡織、服裝、造紙、軍需、化工、建材、生物能源、食品及制藥等多個方面［5-9］。因此，培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高纖、低毒的工業(yè)大麻新品種尤為重要。

誘變育種是利用物理或化學的誘變劑處理植物材料如種子、植物或其他器官，使其遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，產(chǎn)生各種突變，然后在發(fā)生突變的個體中選擇符合人們需要的植株進行培育，從而獲得新品種。隨機擴增多態(tài) DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）具有操作簡便、不需提前知道材料基因信息、檢測靈敏、多態(tài)性強等特點，是目前研究植物種群遺傳變異、種質(zhì)資源評估、栽培植物品種鑒定等方面廣泛采用的一種分子標記法［10］。RAPD技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于作物育種、分子生物學、生態(tài)學、植物抗病性以及植物質(zhì)量性狀的標記等研究領(lǐng)域。鑒于此，本研究利用RAPD分子標記技術(shù)對EMS化學誘變和Co60-γ射線物理誘變進行變異分析，為工業(yè)大麻突變產(chǎn)生提供充分的分子生物學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 化學誘變材料的創(chuàng)建與選擇

試驗于2015年4月28日至2016年9月24日在黑龍江省大慶市東風農(nóng)場進行。用pH 7.5、0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液和二甲基亞砜（DMSO）配制EMS，設(shè)0、0.4%、0.8%、1.25%、2.0% 5個EMS濃度，對火麻一號工業(yè)大麻種子分別浸種處理6 h后，用0.1 mol/L硫代硫酸鈉溶液沖洗5次，每次靜置5 min以終止反應(yīng)［5］。然后播種，行距0.30 m，株距0.03 m，田間管理按一般試驗田進行，按單株收獲。將收獲的M1代種子第二年繼續(xù)播種，小區(qū)面積為2.0 m×2.0 m，采用單粒點播，行距0.30 m，株距0.06 m。田間管理按一般試驗田進行，適時收獲M2代種子。

1.2 物理誘變材料的創(chuàng)建與選擇

利用Co60-γ射線對五常40、農(nóng)安2、火麻一號、格里昂、格里西亞5個工業(yè)大麻干種子進行處理，設(shè)5個劑量，分別為0、50、100、150、200 Gy，劑量率為0.10 Gy/min。處理后的種子直接播種于溫室，田間管理按一般試驗田進行，適時收獲M1代種子。

1.3 RAPD分子標記鑒定

將收獲的工業(yè)大麻種子整齊排列在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，置于人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)，24℃恒溫、光下進行發(fā)芽試驗，一段時間后取葉片樣品，液氮中速凍，存于-80℃待用。取100 mg樣品經(jīng)液氮研磨后，用ProbeGene公司的植物基因組DNA提取試劑盒進行DNA提取，最后溶于100 μL洗脫緩沖液EB中備用。

RAPD分子標記反應(yīng)體系：ddH2O 8.0 μL，2×Taq Master Mix 10.0 μL，DNA 1.0 μL，Primer 1.0 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 5 min；變性94℃ 1 min、復(fù)性36℃ 1 min、延伸72℃ 2 min，35個循環(huán)；再延伸72℃ 5 min，4℃保存。所選引物［11］如表1所示。

表1 大麻RAPD分析適宜的引物及核苷酸序列（5′-3′）

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Gel-Pro analyzer軟件對擴增條帶進行分析，轉(zhuǎn)換成“0”和“1”；然后利用NTSYSpc（W）軟件和SLT_NTsys_2.10e軟件結(jié)合，進行樹狀圖的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA的提取

由于大麻含酚類化合物較多（目前已報道的有61種），在DNA的提取過程中極容易被氧化［12］，本試驗利用DNA提取試劑盒可獲得純度較高的DNA樣品（圖1），RAPD分析標記以提取的DNA樣品為模板進行PCR反應(yīng)。

圖1 誘變材料葉片中提取的DNA

2.2 化學誘變材料的RAPD分析

選擇24株EMS誘變材料進行RAPD分子標記分析，引物OPV-08擴增結(jié)果如圖2所示。對11個引物擴增的結(jié)果進行分析，構(gòu)建樹狀圖，從圖3可以得出，與對照相比基因差異性最大的為c19、c20、c23，其EMS誘變濃度為2%。

圖2 引物OPV-08擴增結(jié)果

2.3 物理誘變材料的RAPD分析

2.3.1 農(nóng)安2 選擇19株物理誘變的農(nóng)安2材料進行RAPD分子標記分析，引物OPI-07擴增結(jié)果如圖4所示。對11個引物擴增的結(jié)果進行分析，構(gòu)建樹狀圖，從結(jié)果（圖5）可以得出，與對照相比基因差異性較大的為c13、c14、 c18、c19，其誘變劑量在150～200 Gy之間。

圖3 火麻一號化學誘變樹狀圖

圖4 引物OPI-07擴增結(jié)果

圖5 農(nóng)安2物理誘變樹狀圖

2.3.2 火麻一號 選擇29株物理誘變的火麻一號材料進行RAPD分子標記分析，引物OPP-12擴增結(jié)果如圖6所示。對11個引物擴增的結(jié)果進行分析，構(gòu)建樹狀圖，從結(jié)果（圖7）可以得出，與對照相比基因差異性較大的為c14、c15、c19、c20，其誘變劑量在100～150 Gy之間。

圖6 引物OPP-12擴增結(jié)果

圖7 火麻一號物理誘變樹狀圖

2.3.3 五常40 選擇13株物理誘變的五常40材料進行RAPD分子標記分析，引物OPU-12擴增結(jié)果如圖8所示。對11個引物擴增的結(jié)果進行分析，構(gòu)建樹狀圖，從結(jié)果（圖9）可以得出，與對照相比基因差異性較大的為c10、c11、 c12、c13，其誘變劑量為150 Gy和200 Gy。

圖8 引物OPU-12擴增結(jié)果

圖9 五常40物理誘變樹狀圖

2.3.4 格里昂 選擇11株物理誘變的格里昂材料進行RAPD分子標記分析，引物OPZ-13擴增結(jié)果如圖10所示。對11個引物擴增的結(jié)果進行分析，構(gòu)建樹狀圖，從結(jié)果（圖11）可以得出，與對照相比基因差異性較大的為c7、c8、c9，其誘變劑量在150～200 Gy之間。

圖10 引物OPZ-13擴增結(jié)果

圖11 格里昂物理誘變樹狀圖

2.3.5 格里西亞 選擇12株物理誘變的格里西亞材料進行RAPD分子標記分析，引物OPY-11擴增結(jié)果如圖12所示。對11個引物擴增的結(jié)果進行分析，構(gòu)建樹狀圖，從結(jié)果（圖13）可以得出，與對照相比基因差異性較大的為c8、c12，其誘變劑量在150～200 Gy之間。

圖12 引物OPY-11擴增結(jié)果

2.3.6 金刀15 選擇33株物理誘變的金刀15材料進行RAPD分子標記分析，引物OPX-13擴增結(jié)果如圖14所示。對11個引物擴增的結(jié)果進行分析，構(gòu)建樹狀圖，從結(jié)果（圖15）可以得出，與對照相比基因差異性較大的為c18、 c20，其誘變劑量為100～150 Gy。

圖13 格里西亞物理誘變樹狀圖

圖14 引物OPX-13擴增結(jié)果

圖15 金刀15物理誘變樹狀圖

3 結(jié)論與討論

本試驗結(jié)果表明，在2%EMS誘變處理工業(yè)大麻種子6 h時，后代發(fā)生的突變率最高。Co60-γ射線誘變后，農(nóng)安2、五常40、格里昂、格里希亞的誘變材料與對照基因差異性較大的處理劑量在150～200 Gy之間；火麻一號的誘變材料與對照相比基因差異性較大的為c14、c15、c19、c20，其誘變劑量在100～150 Gy之間；而金刀15的誘變材料與對照相比基因差異性較大誘變劑量為100～150 Gy之間。與對照差異顯著的誘變材料，其誘變濃度或劑量與之前篩選的適宜誘變濃度或劑量相近?；瘜W誘變濃度是2.0%，處理6 h［5］；Co60-γ誘變劑量基本都在150 Gy左右［13］，所以筆者認為RAPD分子標記也可以作為誘變濃度或劑量的篩選標準。

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