支文雪，詹 陽

（首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院 病理科，北京 100006）

林奇綜合征（lynch syndrome，LS），既往稱為遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌（hereditary nonpolyposis colorectal cancer，HNPCC），是一種常染色體顯性遺傳病，由DNA錯配修復（mismatch repair，MMR）基因 MLH1、MSH2、MSH6 或（和）PMS2的胚系突變導致微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）而引起。其家族易感者一生中均具有發(fā)展成癌的危險性，主要表現(xiàn)為結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌及其它的癌，包括小腸癌、胃癌、膽管癌、卵巢癌、腎盂/輸尿管癌、皮脂腺腫瘤等。LS患者約占所有子宮內(nèi)膜癌（endometrial cancer，EC）患者的2%～3%，EC是LS患者腸外最常見的腫瘤，約50%的LS女性患者臨床首發(fā)癥狀表現(xiàn)為EC[1]，因此 LS相關(guān)性EC（LS-EC）逐漸成為醫(yī)學界關(guān)注的焦點之一。確診EC與LS相關(guān)對LS患者及其家屬的早期診斷、篩查和預防等均有重大意義。近年來，歐美等發(fā)達國家對于LS-EC的研究取得了長足進展，但國內(nèi)相應的研究仍處在起步階段，并未得到相應的重視。本文將就LS-EC的相關(guān)分子機制、檢測方法、臨床病理意義等方面的研究進展進行綜述。

1 分子機制

LS 患者由錯配修復（mismatch repair，MMR）基因胚系突變導致。當 MMR 基因（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2）有缺陷時，錯配不能被修復進而產(chǎn)生突變，尤其是在微衛(wèi)星這種具有重復序列的區(qū)域，從而產(chǎn)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）表型。MMR中不僅有不同種類基因的突變差異，而且也有突變類型的差異。首先，突變類型分為沉默（非病理性）和有害（致病性）突變。其次，有害（致病性）突變再分為截短和非截短突變。截短突變或?qū)е卤磉_喪失，或表達一種易降解的MMR蛋白。非截短突變?yōu)殄e義突變，它是一種點突變，導致MMR蛋白內(nèi)的氨基酸替代，并影響其化學穩(wěn)定性或功能。有害突變通常會導致MMR蛋白的免疫組織化學染色陰性，然而其中的錯義突變導致的功能改變使MMR蛋白仍為免疫反應性，因此免疫組化染色陽性（正常）。一個MMR基因發(fā)生雙等位基因改變/失活才能造成蛋白缺失（二次打擊模型），在MMR基因胚系突變患者中，第二等位基因可經(jīng)體細胞突變和雜合性缺失激活[2]。大約1/3的臨床懷疑為LS的病例（實際為散發(fā)性病例而非遺傳性家族患者）并沒有可識別的致病性突變，其機制是可能為MLH1或MSH2的表觀學突變而非胚系突變[3]，其特征是啟動子甲基化和等位基因的轉(zhuǎn)錄失活。Ligtenberg等人證實上皮細胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule，EPCAM）基因胚系缺失也會導致臨近的MSH2基因沉默。EPCAM基因位于MSH2基因的5'末端，該基因3'末端的胚系缺失會導致上皮細胞中MSH2基因沉默，從而產(chǎn)生MSI表型[4]。

2 檢測方法

LS的診斷始于上世紀80年代，診斷標準幾經(jīng)修訂[5]，AmsterdamⅠ和Ⅱ標準（發(fā)表于1990年及1999年）主要是根據(jù)年齡、個人史及其家族腫瘤病史等臨床資料進行診斷，這也是臨床上診斷林奇綜合征的標準；Bethesda指南在2004年制定了修訂版，與之前的Bethesda指南相比，修訂版更加注重MSI檢測的意義。對于MSI表型的檢測主要有兩種方法：MSI分析（MSI testing）及免疫組化檢測。

2.1 MSI分析（MSI testing）

1997年由美國國立癌癥研究所（national cancer institute，NCI）在“微衛(wèi)星不穩(wěn)定和復制錯誤表型在腫瘤檢測和腫瘤家族性預測中的應用研究會”上發(fā)起對于HNPCC進行微衛(wèi)星狀態(tài)的檢測[6]。該會議推薦5個微衛(wèi)星序列標記，即 BAT25、BAT26、D5S346、D2S123 和 D17S250；并按微衛(wèi)星不穩(wěn)定性發(fā)生頻率分為3型：其中有2個或2個以上發(fā)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定性現(xiàn)象稱為高頻MSI（MSI-H）；如1個發(fā)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定性現(xiàn)象稱為低頻MSI（MSI-L）；如沒有發(fā)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定性現(xiàn)象稱為微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）。該檢測需要腫瘤組織及正常組織同時進行PCR擴增。因為MSS與MSI-L具有相似的生物學行為，將其均歸為MSI陰性（-），而將MSI-H定義為MSI陽性（+）。

2.2 免疫組化檢測

相對而言，一組由4個最易改變的MMR相關(guān)蛋白（MSH2/MSH6/MLH1/PMS2）組成的免疫組化（immunohistochemistry，IHC）檢測項目在試驗研究及臨床應用中最為普遍。相應的抗體在正常黏膜及周圍間質(zhì)和淋巴細胞中為核陽性，當腫瘤組織的核未著色時判定為（-），當出現(xiàn)任一項抗體染色陰性時則判定為 MSI（+）[5]。

IHC檢測結(jié)果與MSI分析有很高的一致性，二者比較，IHC檢測操作方便、花費較少，同時有利于直觀確定突變的基因。在EC中使用IHC方法檢測MSI和篩查LS患者是非常有效的[7，8]。對于MSI分析和免疫組化檢測結(jié)果不一致的病例大部分是由于MLH1啟動子高甲基化或者MMR基因變體；MMR蛋白異質(zhì)性表達則一般是由于MLH1啟動子高甲基化或者腫瘤本身顯微切割區(qū)域?qū)τ贛SI有異質(zhì)性，最常見的是蛋白表達的亞克隆性丟失（未著色細胞占腫瘤細胞的10%～90%）[9]。通過IHC檢測腫瘤樣本的MMR蛋白表達情況而對LS的普遍篩查，已使多種異質(zhì)性的MMR染色模式得到了解釋，在一項前瞻性的研究使用IHC在125例EC中進行LS普篩，發(fā)現(xiàn)MMR蛋白表達的亞克隆缺失在EC中高達7.2%，且一般發(fā)生于子宮內(nèi)膜樣癌中。MLH1亞克隆缺失似乎是一種生物學現(xiàn)象，可以通過甲基化和體系突變事件來解釋，而非胚系突變[10]；單獨的PMS2蛋白缺失可能同樣由于MLH1啟動子高甲基化的異質(zhì)性[11]；然而MSH6蛋白丟失 （伴或不伴MSH2蛋白亞克隆丟失）的分子機制仍不十分清楚[12]。

2.3 其它

在LS的篩檢流程中，對于存在 MLH1免疫組化表達缺失的腫瘤，需要進一步行甲基化檢測以判定MLH1基因啟動子有無超甲基化。如果存在甲基化，更可能是散發(fā)性子宮內(nèi)膜癌，而非LS-EC。經(jīng)IHC或MSI分析方法發(fā)現(xiàn)MSI病例，排除MLH1甲基化者，剩余病例則需進行 MMR基因胚系突變檢測來最終診斷是否為LS患者。MMR基因胚系突變檢測一般從外周血或從手術(shù)切除的正常組織中提取基因組DNA，然后進行測序。隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展及檢測平臺的出現(xiàn)，MMR基因胚系突變的檢測成本越來越低，檢測周期也越來越短。Bente等人運用二代測序技術(shù)在HNPCC患者和EC患者中檢測總大小為1.161 Mb的22個MMR基因的外顯子或內(nèi)含子 （包括 MLH1，MSH2，MSH6，PMS2，MSH3，PMS1，MLH3，EXO1，RFC1，RFC2，RFC3，RFC4，RFC5，PCNA，LIG1，RPA1，RPA2，RPA3，POLD1，POLD2，POLD3和POLD4基因）來篩選致病性種系突變，發(fā)現(xiàn)了5個外顯子的插入/缺失突變、42個外顯子非同義單核苷酸變體和1個內(nèi)含子顯著性變異。檢測結(jié)果既發(fā)現(xiàn)了以往傳統(tǒng)測序已經(jīng)證實的致病性種系突變?nèi)鏜SH2基因的c.187_188insGG突變，也發(fā)現(xiàn)了新的突變，從而提出非常規(guī)檢測的基因可能通過與致病基因的多基因相互作用在HNPCC患者的癌癥發(fā)展中起作用。研究者同時認為有必要采用新的檢測策略來改善風險評估和預防措施，以減輕這種易感人群的疾病負擔[13]。現(xiàn)在有幾家公司正在生產(chǎn)測序套餐和試劑盒來促使MMR基因的大規(guī)模測序得以實現(xiàn)[14]。

3 臨床病理意義

3.1 臨床病理特征

患有LS的女性一生中罹患子宮內(nèi)膜癌的風險為40%～60%，較其患結(jié)腸癌的風險等同或者更高。家族史和個人病史與腫瘤檢測的結(jié)合為診斷EC的女性LS患者提供了有效的方式。MLH1或MSH2基因突變者發(fā)生EC的風險為25%～60%，MSH6基因突變者發(fā)生 EC的風險為16%～26%，而PMS2基因突變者為15%[15]。對于EPCAM缺失的攜帶者發(fā)生子宮內(nèi)膜癌的累積風險率為12%，這種風險局限于MSH2基因啟動子外延的缺失[16]。女性LS患者的干預措施包括預防性子宮雙附件切除術(shù)和化學性預防。對于LS家系的監(jiān)測根據(jù)攜帶不同的突變基因型而定，對于MLH1/MSH2基因突變攜帶者，建議從20～25歲開始每1～2年做1次腸鏡、婦科及泌尿道檢查；MSH6/PMS2基因突變攜帶者，則建議從25～30歲開始每1～2年做1次腸鏡檢查和婦科檢查[17]。

與具有明顯臨床病理特征的MSI（+）結(jié)直腸癌不同，MSI（+）與 MSI（-）子宮內(nèi)膜癌之間的臨床病理特征的差異并不十分明確。大多數(shù)研究并沒有發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜癌中MSS患者與MSI患者之間的發(fā)病年齡存在差異。然而進一步按照是否有胚系突變分組后發(fā)現(xiàn)LS-EC患者較為年輕，LS-EC平均發(fā)病年齡為53.4歲，散發(fā)性MSI-EC平均發(fā)病年齡為63.6歲，MSS-EC平均發(fā)病年齡為66.8歲[18]。MSI相關(guān)子宮內(nèi)膜癌更多見于子宮內(nèi)膜樣癌和 I型癌中，可能表現(xiàn)出其特有的組織學特征，包括篩狀結(jié)構(gòu)、粘液分化、壞死、無乳頭生長及腫瘤異質(zhì)性[19]。有研究顯示，子宮內(nèi)膜癌中MSI與淋巴細胞浸潤的相關(guān)性。與MSS相比，MSI-H者間質(zhì)中免疫細胞增多，包括粒酶B+細胞，活化的 CTLs細胞和 PD-L1+（程序性細胞死亡配體 1，programmed cell death ligand 1）細胞。在 MSI-H的EC中散發(fā)性EC和LS-EC中在免疫細胞群中表現(xiàn)出明顯的差異，表明微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的機制改變了免疫應答。MSI-H的LSEC中間質(zhì)中CD8+細胞和活化的CTL細胞增多，間質(zhì)和腫瘤中的巨噬細胞減少[20]。這些數(shù)據(jù)近期被Sloan等研究者證實，他們的研究表明LS-EC中PD-L1表達增強[21]。

3.2 預后及治療

一直以來，對于MSI-H與腫瘤預后之間的關(guān)系有很多的研究。針對EC有研究發(fā)現(xiàn)具有MSI的早期EC更易出現(xiàn)淋巴血管間隙浸潤，且更易發(fā)生遠端復發(fā)并影響總體生存[22]；Talhouk等同時也發(fā)現(xiàn)MMR蛋白缺陷的EC患者更易出現(xiàn)淋巴血管間隙浸潤，分期更晚，更易出現(xiàn)在接受放化療的“高危”患者中[23]，然而迄今為止仍沒有公認的確切研究結(jié)果。

臨床研究中發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星狀態(tài)與腫瘤對化療的反應有關(guān)。在MSI陽性結(jié)腸直腸癌患者中，研究5-氟尿嘧啶（5-Fu）療效的研究結(jié)論認為與MSS腫瘤相比，MSI陽性結(jié)腸直腸癌對化療藥物的反應不同，其患者并不能從以5-Fu為基礎(chǔ)的輔助化療中獲益[24]。子宮內(nèi)膜癌的化療方案一般以鉑類和紫杉醇為基礎(chǔ)，MSI與子宮內(nèi)膜癌化療的相關(guān)性仍不明晰，需要更多的臨床隨機前瞻性或回顧性研究。

近年來對于惡性腫瘤靶向治療的研究廣泛開展，其中在MSI（+）腫瘤與免疫靶向治療之間的研究更是取得了重大成果。研究者發(fā)現(xiàn)使用抗PD1（程序性細胞死亡1，programmed cell death 1）的免疫檢查點抑制劑pembrolizumab（帕母單抗）治療的患者中，MMR缺陷結(jié)直腸癌者表現(xiàn)出較MMR未缺陷者更高的免疫相關(guān)反應率和免疫相關(guān)無進展生存率；而其他種類MMR缺陷腫瘤（非結(jié)直腸癌）患者較未缺陷者存在更多的體細胞突變（P=0.007），而高體細胞突變負荷與延長無進展生存期相關(guān) （P=0.02）[25]。2017年5月美國FDA批準了將抗PD1與PDL1的免疫抑制劑應用于MSI-H的實體腫瘤。Sloan等人評估了PDL1在MMR缺陷的子宮內(nèi)膜癌（包含LS-EC與MLHI高甲基化者）與未缺陷者中的表達情況，發(fā)現(xiàn)LS-EC相對于MLH1甲基化者 （散發(fā)性MMR缺陷子宮內(nèi)膜癌）PDL1陽性率更高（70%vs 33%，P=0.05），而只有10%未缺陷者表達PDL1，這顯著低于在MMR缺陷型腫瘤中的陽性率（P=0.0005）；MSH6蛋白缺失與PDL1表達最相符[21]。該研究表明，相對于MLH1甲基化和MMR未缺陷腫瘤，腫瘤性PD-L1表達在LS-EC中更常見，MMR缺陷可能是EC對PD-1/PD-L1抑制劑治療反應中的預測指標，為將來LSEC的個體化治療提供了更多的選擇。

4 小結(jié)

針對LS-EC的研究大多為國外研究，國內(nèi)研究尚處于起步階段，盡管大部分病理科已經(jīng)開展針對MMR蛋白的免疫組化檢測，然而國內(nèi)對于遺傳性腫瘤的家系篩查、遺傳咨詢及遺傳家族的健康管理仍然比較滯后。鑒于其臨床意義重大，我們希望通過這篇綜述引起婦產(chǎn)科及病理科醫(yī)生對于LS-EC的足夠重視，同時希望國內(nèi)能夠開展大規(guī)模、多中心的研究來獲得中國人群中LS-EC的發(fā)生率、臨床病理特征、基因改變、預后相關(guān)性和治療預測價值等信息，以填補該研究領(lǐng)域的空白。