郭卓釗，陳 宇，黃妙云，郭美媛，白衛(wèi)東，劉曉艷

0 引言

彈性蛋白酶（EC3.4.4.7，Elastase） 是一種含有絲氨酸的肽鏈內(nèi)切酶，其對甘氨酸、丙氨酸殘基具有很高的水解特異性。由于彈性蛋白中甘氨酸、丙氨酸含量達(dá)55%以上，故彈性蛋白酶能高效水解由丙氨酸、亮氨酸等非極性氨基酸殘基交聯(lián)而成的具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的不溶性彈性蛋白（Elastin）[1]。彈性蛋白酶具有抗動脈硬化、改善脂類代謝的作用，可以作為防止動脈粥樣硬化，治療高血脂癥、脂肪肝的生化藥物[2]，療效確切、安全可靠。同時，其高效水解彈性蛋白特性又可在食品工業(yè)中作為嫩化劑，在日用化工中作為洗滌劑等，具有廣闊的應(yīng)用前景及較高的商業(yè)價值。

1 彈性蛋白酶的分布與來源

彈性蛋白酶主要分布于動物及一些微生物中，某些植物中也可能具有彈性蛋白酶活力物質(zhì)。

1.1 動物源

彈性蛋白酶在動物體內(nèi)主要存在于動物的胰臟中，由Balo J等人[3]在1949年最先分離純化得到，其含量可能與動脈粥樣硬化癥有關(guān)[4]。

目前的研究表明，哺乳動物（包括人）、昆蟲和魚等的細(xì)胞中都有彈性蛋白酶的存在。哺乳動物（包括人）中，彈性蛋白酶主要存在于動物的胰臟、脾臟細(xì)胞中；另外，動物的其他組織里也都有一定量的存在，如皮膚、皮下細(xì)胞、主動脈、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、白血球等。已有報道分別從哺乳動物豬[5-6]、鼠[7]和羊[8]的胰臟中分離純化得到彈性蛋白酶結(jié)晶，并對其進(jìn)行了分子量及功能測定、動力學(xué)及性質(zhì)分析。在某些昆蟲的幼蟲體內(nèi)也曾分離得到彈性蛋白酶[9]。

有關(guān)魚類彈性蛋白酶的研究比較少，主要集中在國外。其中，非洲肺魚[10]、鰓魚[11]、鯉魚[12]、金槍魚[13]、角鱉[14]、虹蹲魚[15]、大西洋鰭魚[16]和蛙魚[17-18]等魚類的胰彈性蛋白酶的純化和鑒定工作已有研究和報道。來源于不同動物的胰彈性蛋白酶的水解效率有一定差別，通常情況下，來自于魚類的胰彈性蛋白酶的水解效率比來自于哺乳動物的彈性蛋白酶高[19]。

1.2 微生物源

1960年，Mandl I等人[20]首次從黃桿菌-Flavobacterium elastolyticium中分離得到微生物源的彈性蛋白酶，該菌是從牙周病患者的送檢樣品中分離，能產(chǎn)生專一降解彈性蛋白的胞外蛋白酶。1974年，Shioo I等人[21]篩選出134株產(chǎn)彈性蛋白酶的菌，分別屬于假單孢桿菌屬（Pseudomonas sp）、芽孢桿菌屬（Bacillus sp）、黃質(zhì)菌屬（Flavobacterium sp）、鏈霉菌屬（Streptomyces sp）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp）、無色細(xì)菌屬（Achroobacter）、微球菌屬（Micrococcus sp.）。

1975年，Morihara K[22]報道了多種芽孢桿菌可以產(chǎn)彈性蛋白酶。之后的研究表明，細(xì)菌、酵母菌、霉菌、放線菌中都有產(chǎn)彈性蛋白酶能力的菌株[23]。

目前，研究較多的產(chǎn)彈性蛋白酶的酶學(xué)特性的菌株有嗜堿芽孢桿菌（Bacillus alkalophilic）[24]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[25]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[26]、 假 單 胞 菌 （Pseudomonas sp.）[27]、芳香黃桿菌（Flavobacterium odoratum）[28]、地衣芽孢桿菌 （Bacillus licheniformis）[29]等菌株。

1.3 其他

利用分子生物學(xué)技術(shù)克隆基因構(gòu)建產(chǎn)彈性蛋白酶工程菌株，是今后彈性蛋白酶的研究熱點，目前在國內(nèi)外已有所報道。

宋笛等人[30]從芽孢桿菌中克隆得到彈性蛋白酶并命名為TX1，并連入pEAZY E1載體，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pEAZY E1-TX1。重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)基因表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni柱純化后通過pH-stat測定其制備大豆肽的水解能力。序列分析結(jié)果表明TX1基因長度為1 143 bp，與Genbank上已報道序列（JQ305692.1） 同源性最高為99.48%，產(chǎn)生的堿基突變不影響其氨基酸編碼。蛋白表達(dá)分析結(jié)果表明，當(dāng)IPTG濃度為0.3 mmol/L，誘導(dǎo)4 h蛋白表達(dá)量最高。經(jīng)SDS-PAGE和Western分析結(jié)果表明，經(jīng)Ni離子親和層析純化獲得量大小為39.4 ku的彈性蛋白酶His-TX1。

谷新晰[31-32]以1株產(chǎn)彈性蛋白酶的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa） 基因組 DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的銅綠假單胞菌彈性蛋白酶（P.aeruginosa elastase，PAE） 基因，與GenBank中的序列對比發(fā)現(xiàn)同源性為99%。成功地構(gòu)建了重組表達(dá)載體pPIC3.5K/PAE，重組質(zhì)粒Sac I線性化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母（Pichia pastoris） 菌株KM71中，通過PCR和表型鑒定表明，PAE基因已經(jīng)整合到畢赤酵母染色體上。經(jīng)大量篩選獲得48株含高拷貝的重組畢赤酵母轉(zhuǎn)化子。在甲醇誘導(dǎo)下，經(jīng)過畢赤酵母高密度發(fā)酵進(jìn)行PAE的表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果表明，在培養(yǎng)基上清中含有一明顯特異性蛋白條帶，大小為34 kD活性檢測結(jié)果，酶活為1 060 U/mL，是出發(fā)菌株的26倍。

2 彈性蛋白酶的性質(zhì)

彈性蛋白酶一般為白色針狀結(jié)晶或淡黃色、深黃色粉末，也可以是淺褐色或褐色液體，有吸濕性，溶于水，不溶于乙醇[33]。

彈性蛋白酶的來源不同，其酶的氨基酸組成和部分結(jié)構(gòu)、分子量也不一定相同。由動物胰臟提取純化的彈性蛋白酶分子量為24～29 kDa，如中國鱟胰彈性蛋白酶相對分子量為28.5 kDa，鼠29 kDa，牛29 kDa，綿羊25 kDa，雞25 kDa，大西洋鱈魚24.8 kDa[34]，大西洋鮭27 kDa[35]。由微生物提取的彈性蛋白酶其分子量從21 000～39 500，如枯草芽胞桿菌蛋白酶subtilisin的分子量為31 kDa[36]。

作為同功不同源的蛋白質(zhì)，不同來源的彈性蛋白酶作用也不相同。一般來講，胰彈性蛋白酶不但能降解其天然底物——彈性蛋白，而且對除毛發(fā)角蛋白以外的大多數(shù)蛋白，如酪蛋白、膠原蛋白、白蛋白、血纖維蛋白、血紅蛋白等都具有水解特性。而不同微生物來源的彈性蛋白酶，其分解底物的特點是不同的。有的微生物源彈性蛋白酶只能降解彈性蛋白，有些卻具有較廣的水解特性。即使是同一菌種，但來自不同地區(qū)的，所產(chǎn)生的彈性蛋白酶可能有完全不同的水解底物的特性。

多數(shù)彈性酶蛋白的等電點較高（5.7～10）[37-38]。胰彈性蛋白酶的最適pH值與最適溫度一般與人體接近，而微生物產(chǎn)生的彈性蛋白酶最適pH值和最適溫度穩(wěn)定范圍要比一般的蛋白酶高，目前研究發(fā)現(xiàn)其在中性偏堿性范圍內(nèi)具有較高的活性，最適pH值最高值是9.0，最適作用溫度在50～60℃，耐受溫度的最高值達(dá)70℃[39-40]。

3 彈性蛋白酶在食品中的應(yīng)用

食品加工過程中，許多動、植物蛋白質(zhì)，特別是韌帶、大動脈血管、筋腱等含膠原蛋白和彈性蛋白較高的物質(zhì)往往由于硬度及韌度較高而較難利用。彈性蛋白酶可以高效水解硬度及韌度高的彈性蛋白和膠原蛋白，使其口感變好，因此在農(nóng)副產(chǎn)品深加工、罐頭加工、高蛋白質(zhì)食品的制作等方面將會得到廣泛應(yīng)用。

肉類加工中常會采取一些物理或生物的嫩化方法，使肉制品獲得較好的嫩度。其中，對于外源酶法，最常用于肉類嫩化的酶主要是從菠蘿、木瓜和無花果等植物果實中提取的蛋白酶。彈性蛋白酶也可以作為嫩化劑應(yīng)用于肉類工業(yè)。韓建春等人[41]發(fā)現(xiàn)，通過彈性蛋白酶溶液浸泡，可以提高豬肉的嫩度。彈性蛋白酶的添加使牛主動脈的組織紋理打破，出現(xiàn)斷裂和孔隙，可以使牛主動脈的韌度下降。李益恩等人[42]采用0.001%彈性蛋白酶作為嫩化劑，結(jié)合0.25%復(fù)合磷酸鹽與工程法速溶調(diào)味料溶液注射及真空滾揉技術(shù)，獲得嫩化鹵牛肉的新工藝，縮短了牛肉鹵煮時間，提高了牛肉的持水性，使鹵牛肉嫩度大幅度提高。

常用的肉類嫩化劑，如木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶或無花果蛋白酶等，在酶解時經(jīng)常會出現(xiàn)肌肉過度水解，而堅韌的結(jié)締組織中的膠原和彈性硬蛋白沒有作用的情況。由于彈性蛋白酶能夠高效地水解硬度和韌度較高的結(jié)締組織中的膠原和彈性硬蛋白，且會優(yōu)先水解彈性蛋白[43]，達(dá)到肉類軟化而又不過度水解的目的。劉書亮等人[44]研究表明，對于彈性蛋白、明膠、干酪素、牛血清白蛋白5種不同蛋白質(zhì)及牛肉、牛肚、牛筋、豬肉和豬皮5種肉類蛋白質(zhì)，不同來源的彈性蛋白酶可以對其進(jìn)行不同程度的水解，木瓜蛋白酶也能降解彈性蛋白外的其他蛋白質(zhì)。彈性蛋白酶處理的肉類樣品的嫩度明顯優(yōu)于木瓜蛋白酶處理的肉類樣品。關(guān)國雄等人[45]的研究表明，具有相同酪蛋白水解活力的彈性蛋白酶對于堅韌的牛胃肌、牛筋鍵等效果尤佳，而木瓜蛋白酶對堅韌肉類蛋白的消化能力較差。劉鷺[46]對彈性蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解能力進(jìn)行了對比。結(jié)果表明，對于卵白蛋白、明膠、大豆分離蛋白、牛血清白蛋白，在相同的酶活力下，彈性蛋白酶水解卵白蛋白的能力較高，而對其他蛋白的水解能力較低；對于彈性蛋白，彈性蛋白酶對其不僅有優(yōu)先水解的能力，且水解能力較強(qiáng)，而木瓜蛋白酶對其無水解能力；對于彈性蛋白含量豐富的牛胃、豬皮及純的彈性蛋白樣品，彈性蛋白酶的水解能力是木瓜蛋白酶的20多倍。豬皮和牛肉經(jīng)過彈性蛋白酶處理后，其剪切值都遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于未經(jīng)處理或用木瓜蛋白酶處理的樣品，彈性蛋白酶處理的樣品的嫩度明顯優(yōu)于木瓜蛋白酶處理的樣品。也就是說，當(dāng)彈性蛋白與其他蛋白質(zhì)共存時，由于彈性蛋白對酶具有強(qiáng)親和力，使得酶對彈性蛋白優(yōu)先水解。因此，相對于其他蛋白酶，彈性蛋白是一種更為理想的肉類嫩化劑，在食品業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用前景。

彈性蛋白酶也可以作為益生菌保健食品的促菌劑[47]及嬰兒食品的強(qiáng)化劑[48]等應(yīng)用于食品工業(yè)。楊遠(yuǎn)帆等人[49]應(yīng)用彈性蛋白酶提取牛蛙皮膠原蛋白，使牛蛙皮膠原蛋白的提取率達(dá)到47.7%，表明彈性蛋白有良好的應(yīng)用前景。

4 彈性蛋白酶利用前景及存在的問題

在我國，從豬胰臟中提取彈性蛋白酶是獲取彈性蛋白酶的主要途徑，但該方法由于原料（豬胰臟）的來源有限，而且酶的含量不高（每1 kg鮮胰臟含彈性蛋白酶僅210 000 U），造成酶的獲取成本較高[50]，制約了彈性蛋白酶的生產(chǎn)。而利用微生物分泌胞外酶的方法生產(chǎn)彈性蛋白酶，該培養(yǎng)條件簡單、生產(chǎn)周期短，容易實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，且酶的提取純化較容易，因此具有較好的發(fā)展前景。但是利用微生物生產(chǎn)彈性蛋白酶還存在一些問題需要解決。

（1）目前的報道表明，分離得到的彈性蛋白酶產(chǎn)生菌株大部分都具有致病性，對人體存在著潛在的危害，制約著其在商業(yè)上的應(yīng)用。例如，目前報道的產(chǎn)酶菌株中主要是銅綠假單孢菌（Pseudomonas aeruginosa)[51]、產(chǎn)吲哚金黃桿菌（Chryseobacterium indologenes） 等[52]。

芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）具有生物安全性較高的特點，因而常作為工業(yè)酶制劑生產(chǎn)菌株。國內(nèi)的王金英[53]、陳啟和[54]及張娟等人[55]均篩選出產(chǎn)彈性蛋白酶的枯草芽孢桿菌，因此，枯草芽胞桿菌是潛在的工業(yè)化生產(chǎn)彈性蛋白酶菌株，受到普遍關(guān)注，但枯草芽胞桿菌的酶活都比較低。

（2）多數(shù)微生物生產(chǎn)的彈性蛋白酶的活力不高。殷文靜[33]從肉聯(lián)廠附近的土壤和污水中分離得到了19株能分泌胞外彈性蛋白酶的假單胞菌屬菌株，但只有3株產(chǎn)酶活力超過15 U/mL。詹莉[48]篩選的209株產(chǎn)彈性蛋白酶的菌株中，酶活力最高的菌株SCELOI的酶活力只有33 U/mL，經(jīng)誘變改性后達(dá)到45 U/mL。現(xiàn)有的報道中，酶活較高的是嗜堿菌Bacillus sp.XE22-4-1，該菌由中國科學(xué)院微生物研究所從西藏天然堿湖中篩選得到，其酶活力達(dá)300 U/mL[56]。2016年，舒會[51]從深海海泥中篩選得到1株蛋白酶耐鹽穩(wěn)定性好的深海銅綠假單胞菌，酶活力可達(dá)750 U/mL，是目前報道的產(chǎn)彈性蛋白酶最高的菌株。

（3）對微生物來源的彈性蛋白酶的結(jié)構(gòu)研究較少，其構(gòu)成及結(jié)構(gòu)尚不明確。目前的研究發(fā)現(xiàn)，來自胰臟的彈性蛋白酶和來自銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）的彈性蛋白酶都不只含有1個酶組分，銅綠假單胞菌RAKS-I產(chǎn)生的彈性蛋白酶至少由2個酶組分構(gòu)成[57]。人體中性彈性蛋白酶其一級結(jié)構(gòu)是由218個氨基酸殘基構(gòu)成，該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)包含2個由Asn連接的碳?xì)滏?，?對二硫鍵連接起來。其反應(yīng)性絲氨酸附近的氨基酸殘基排列順序為-Gl-Asp-Ser-Gly-[58]。

王超等人[59]發(fā)現(xiàn)，枯草芽胞桿菌彈性蛋白酶subtilisin的三維結(jié)構(gòu)含有6個α-螺旋，7個扭曲的平行β-折疊以及2個反平行的β-折疊，His，Asp和Ser是其活性中心的關(guān)鍵基團(tuán)。但其他微生物產(chǎn)的彈性蛋白酶的結(jié)構(gòu)尚不明確。

（4）彈性蛋白酶一般不能在低溫和酸性條件下應(yīng)用。彈性蛋白酶最適水解溫度一般在50～60℃，這個最適溫度不利于肉類的防腐保鮮，這使得普通的彈性蛋白酶在肉類工業(yè)中的應(yīng)用受到極大的限制。

低溫型彈性蛋白酶在較低溫度下酶活仍較高，能在25℃左右水解彈性蛋白，同時較低的溫度可抑制肉類腐敗菌的生長，因此低溫型彈性蛋白酶在肉類工業(yè)中的應(yīng)用比普通的彈性蛋白酶更具有前景及優(yōu)勢。樊陳等人[60]成功篩選出1株高產(chǎn)突變菌株XZU21，其最大產(chǎn)酶量160.3 U/mL，最佳反應(yīng)pH值9.5，溫度20℃，比原始菌株低5℃。高兆建等人[61]篩選得到彈性蛋白酶最適作用溫度25℃，在40℃以下保溫2 h，酶穩(wěn)定性好。

彈性蛋白酶在酸性條件下活性較低,限制了其應(yīng)用范圍，需進(jìn)行改性研究。孟喜龍等人[62]采用2種化學(xué)修飾劑對彈性蛋白酶進(jìn)行修飾，修飾后的酶與未經(jīng)修飾的酶相比，2種修飾酶活性均能保留在原酶的60%以上，用MPEG修飾酶的保留活性更高（85.5%），而且2種修飾酶在耐熱性、耐酸性等方面都優(yōu)于天然酶。

（5）微生物彈性蛋白酶的合成、分泌和調(diào)控機(jī)制還不明了。要生產(chǎn)及利用微生物來源的彈性蛋白酶，最關(guān)鍵的問題就是要獲得無毒的能高產(chǎn)彈性蛋白酶的菌株，并利用優(yōu)化培養(yǎng)條件及誘變等一系列方法使得菌株的酶產(chǎn)量更高。與此同時，在彈性蛋白酶的合成機(jī)制方面，分泌和調(diào)控機(jī)制等方面還要進(jìn)行深入的研究，縮短其進(jìn)行藥理、毒理及藥效試驗的時間，從而進(jìn)一步擴(kuò)大彈性蛋白酶在醫(yī)藥、化工、食品等各個方面的應(yīng)用。但目前，該方面的研究結(jié)果還不明了，阻礙了生產(chǎn)及應(yīng)用微生物源彈性蛋白酶的進(jìn)展，延緩了微生物彈性蛋白酶的研究與應(yīng)用。

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