程 斌， 辛智海， 高 旭， 隋建樞， 曹 寧， 丁延慶， 何慶才， 張立異

（1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱糧研究所， 貴陽550006； 2.貴州大學(xué)生命科學(xué)院， 貴陽550025）

在水稻、玉米和高梁等谷類作物中都存在由自然變異形成的糯性類型，并有糯性品種（系）應(yīng)用于生產(chǎn)。然而，同為谷類作物的普通小麥，迄今為止自然界尚未發(fā)現(xiàn)其糯性類型。1993年日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在控制小麥的籽粒直鏈淀粉合成中，有一種酶起著主要作用，這種酶就是顆粒結(jié)合淀粉合成酶（Granule－bound starch synthase I，簡稱GBSSI），也稱 Waxy蛋白。直鏈淀粉含量較高的小麥存在Waxy蛋白，而直鏈淀粉含量很低的小麥缺少甚至沒有 Waxy蛋白，Waxy蛋白的存在與否決定著谷物的糯性和非糯性，編碼Waxy蛋白的等位基因被命名為Wx基因。普通六倍體小麥（Triticum aestivumL.，AABBDD）含有3種Wx 蛋白亞基：Wx－A 1、Wx－B 1和 Wx－D 1，分別位于染色體7 AS、4AL和7DS上，它們相應(yīng)的表達(dá)型等位基因為Wx－A1a、Wx－B1a、Wx－D1a，相應(yīng)的缺失型為 Wx－A1b、Wx－B1b、Wx－D1b［1］。任一種蛋白亞基的缺失或失活可導(dǎo)致直鏈淀粉含量降低，一方面可能是更多物質(zhì)參與支鏈淀粉合成，導(dǎo)致直鏈淀粉合成的絕對量下降；另一方面可能是直鏈淀粉含量下降，支鏈淀粉含量不變，導(dǎo)致直鏈淀粉相對量的減少。3個蛋白亞基均存在天然缺失，如日本小麥品種關(guān)東107缺失Wx－A 1和Wx－B 1蛋白亞基，中國地方品種白火麥缺失 Wx－D 1蛋白亞基，其相應(yīng)基因被分別命名為Wx－A1b、Wx－B1b和Wx－D1b。Nakamura等［2］在關(guān)東107小麥和白火麥雜交后代中選育出了世界上第一個直鏈淀粉含量在0.6%～0.7%之間的糯小麥。

糯小麥的低直鏈淀粉含量這一特性使其在面條加工業(yè)、淀粉加工業(yè)及其它工業(yè)上有著重要的用途。比如可以提高面條的品質(zhì)；低直鏈淀粉品種穗不易發(fā)芽，避免收獲前的產(chǎn)量損失，還能避免加工中α－淀粉酶活性升高造成的面粉質(zhì)量下降；糯小麥的面粉可以用于配粉，提高面條的品質(zhì)，改善饅頭的白度，延長速凍食品的貨架壽命；糯小麥還可以用于生產(chǎn)環(huán)保塑料、糯米紙類食品包裝紙、硬紙板、濃縮劑、漿糊、涂料原料、紡織業(yè)的打漿劑等；特別是糯小麥在釀酒方面具有較大利用價值。趙國君等研究表明，在酒廠生產(chǎn)條件下，糯小麥白酒有相對較高的出酒率和雜醇類物質(zhì)含量、適中的酸類和酯類物質(zhì)含量、較低的醛類物質(zhì)含量，糯小麥白酒在氣味和口感方面優(yōu)于其它試驗組白酒［3］。貴州是白酒的主產(chǎn)區(qū)，對釀酒原料需求大，選育出適應(yīng)貴州種植的酒用糯小麥，在改善貴州白酒品質(zhì)的同時，還可以增加農(nóng)民收益，實現(xiàn)雙贏的局面。

分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)（Marker Assisted Selection，MAS）是利用與目標(biāo)性狀緊密連鎖的DNA分子標(biāo)記對作物目標(biāo)性狀進(jìn)行間接選擇，在早代就能夠?qū)δ繕?biāo)基因的轉(zhuǎn)移進(jìn)行準(zhǔn)確、穩(wěn)定的選擇，而且克服隱性基因再度利用時識別的困難，從而加速育種進(jìn)程，提高育種效率，選育抗病、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的新品種。MAS技術(shù)在小麥的分子育種中得到了廣泛應(yīng)用。在糯小麥的 MAS中，舒守貴等［4］以中國春糯性位點全套近等基因系為研究材料，用小麥Wx基因的6個STS標(biāo)記和1個CAPS標(biāo)記進(jìn)行了篩選；張晶等［5］對173份小麥的蛋白質(zhì)亞基進(jìn)行分子標(biāo)記掃描并構(gòu)建了多重 PCR；王亮等［6］利用 Wx－A 1、Wx－B 1和 Wx－D 1位點的3個STS標(biāo)記對250份新疆小麥品種Wx基因的組成進(jìn)行了鑒定，同時測試了185份冬、春小麥品種的淀粉糊化特性。

為了提高適應(yīng)貴州生產(chǎn)的抗病糯小麥的育種效率，本實驗采用 Wx－B1、Wx－A1、Wx－D1基因的分子標(biāo)記［7－8］，對本地優(yōu)良品系與糯小麥的雜交后代進(jìn)行Wx基因鑒定與篩選，評估分子標(biāo)記在糯質(zhì)小麥MAS育種中的應(yīng)用，為加快糯性小麥新品種的選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

本實驗采用小麥品系俞糯麥、自育品系0117以及雜交F2代的56個單株為試驗材料。俞糯麥為不攜帶任何3個Wx基因的全糯質(zhì)小麥材料，由重慶地區(qū)農(nóng)科所提供。自育品系0117是一個綜合性狀較好并具有良好抗性的完全非糯質(zhì)小麥品系，由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱糧研究所選育并提供。

1.2 Wx基因檢測標(biāo)記

實驗中使用的3對Wx基因分子標(biāo)記中，與等位基因Wx－A1a／b和Wx－D1a／b連鎖的標(biāo)記是SSR標(biāo)記，而與Wx－B1a／b連鎖的標(biāo)記是STS標(biāo)記。它們名稱、序列信息及擴(kuò)增片段大小如表1所示。

1.3 DNA提取及PCR分析

親本及群體種子發(fā)芽，幼苗培養(yǎng)至一葉一心，基因組DNA的提取采用CTAB法［9］，略做改動，將DNA樣品稀釋到50ng／μL備用。

PCR 擴(kuò)增SSR 引物根據(jù)http：／／www.graingenes.org公布的引物序列，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。在 MJ Research PTC－200型PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系（15μL）：DNA 模板5.0 μL；10×Buffer 2.0μL；MgCl21.2μL；2.5mmol／L dNTP 0.4μL；10mmol／L 引物各0.8μL；2.5U／μL Taq酶0.2μL；ddH2O 4.6μL。

基本反應(yīng)條件：94℃3min；94℃2min，58℃／61℃1min（視引物退火溫度而定），72℃2min，35個循環(huán)；72℃延伸10min；10℃保存。取3μL擴(kuò)增產(chǎn)物在6%非變性連續(xù)PAGE上恒壓（130～150V），電泳2～2.5h，銀染，凝膠自動成像系統(tǒng)觀察、照相?；蛘呷?2.5μL擴(kuò)增產(chǎn)物在0.8%的瓊脂糖膠上100V，電泳30min，EB染色，凝膠自動成像系統(tǒng)觀察、照相。

表1 Wx基因的分子標(biāo)記

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

本研究利用Excel軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計和卡方驗證分析?？ǚ津炞C是將實際比數(shù)與理論比數(shù)進(jìn)行比較，以確定二者的符合程度，從而確定某一分離比例是否能用某種遺傳規(guī)律去解釋。計算公式為：

卡方值（X2）＝（觀測值－理論值）2／理論值。

2 結(jié)果與分析

2.1 Wx基因標(biāo)記掃描結(jié)果

自育品系0117是完全非糯質(zhì)小麥，其基因型為Wx－A1a、 Wx－A1a／Wx－B1a、 Wx－B1a／Wx－D1a、Wx－D1a，而俞糯麥?zhǔn)侨促|(zhì)小麥，其基因型Wx－A1b、Wx－A1b／Wx－B1b、Wx－B1b／Wx－D1b、Wx－D1b。利用與3個糯質(zhì)基因Wx－A1、Wx－B1和Wx－D1緊密連鎖的分子標(biāo)記 Mag 264、BDFL／BRD和 Mag 269掃描2個親本以及56個F2代的單株，結(jié)果如圖1所示。

Mag 264為共顯性標(biāo)記（SSR），獲得2個擴(kuò)增片段分別為336bp和317bp，其中317bp片段與糯質(zhì)等位基因位點Wx－A1b連鎖。56個F2后代中，10個單株攜帶非糯質(zhì)的等位基因位點Wx－A1a，基因型為Wax－A1a、Wax－A1a，為非糯質(zhì)小麥；14個單株攜帶糯質(zhì)的等位基因位點Wax－A1b，基因型為Wax－A1b、Wax－A1b，為糯質(zhì)小麥；其余25個單株是雜合體，基因型為Wax－A1a、Wax－A1b，為非糯質(zhì)小麥，另外有7個單株未檢測到條帶。利用卡方檢驗，在顯著水平p＞0.05時，X2＝0.714，說明該位點在F2代群體分離比符合AA∶Aa∶aa＝1∶2∶1的分離比（圖1，表2）。

BDFL／BR為顯性標(biāo)記（STS），PCR擴(kuò)增產(chǎn)生一個425bp片段，與非糯質(zhì)的等位基因Wx－B1a緊密連鎖。56個F2后代中，32個單株攜帶此片段，說明它們的 基因型 為Wx－B1a、Wx－B1a 或Wx－B1a、Wx－B1b，應(yīng)為非糯性小麥；24個單株沒有此位點，說明其基因型為Wx－B1b、Wx－B1b，為糯性小麥。利用卡方檢驗，在p＞0.05時，X2＝0.002，說明F2代分離比符合（BB＋Bb）∶bb＝3∶1（圖2，表2）。

Mag 269為共顯性標(biāo)記（SSR），但是在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果中卻表現(xiàn)為顯性標(biāo)記，可能是Wx－D1基因3’端大片段缺失的雜合體DNA結(jié)構(gòu)會影響PCR的擴(kuò)增［8］，PCR 擴(kuò)增獲得2個片段分別為1 400bp和800bp，其中800bp片段與糯質(zhì)基因Wx－D1b連鎖。56個F2后代中，22個單株攜帶非糯質(zhì)的等位基因位點Wx－D1a，為非糯質(zhì)小麥；34個單株攜帶糯質(zhì)的等位基因位點Wx－D1b。該位點在F2代的分離符合DD∶（Dd＋dd）＝1∶3的分離比（X2＝0.136，p＞0.05）（圖3，表2）。

圖1 標(biāo)記Mag 264在品系0117和俞糯麥的F2代群體部分單株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 標(biāo)記BDFL／BR在品系0117和俞糯麥的F2代群體部分單株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖3 標(biāo)記Mag269在品系0117和俞糯麥的F2代群體部分單株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

表2 F2后代Wx基因位點掃描結(jié)果

續(xù)表2

2.2 F2代群體中糯質(zhì)小麥出現(xiàn)的頻率

對3個標(biāo)記的掃描結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，在56個F2代分離群體中，3個基因位點都存在的材料有4株（7.14%）；單缺失 Wx－A1a 或 Wx－B1a 或 Wx－D1a基因位點的材料編號分別為5（8.93%）、8（14.29%）和19（33.93%）；Wx－A1a 和Wx－B1a 基因位點同時缺失的材料為5株（8.93%）；Wx－A1a 和 Wx－D1a 基因 位點 同 時 缺 失 的 材 料 為 4 株 （7.14%）；Wx－B1a 和Wx－D1a基因位點同時缺失材料為11株（19.64%）；3個基因位點都缺失的全糯質(zhì)單株未發(fā)現(xiàn)。

3 討 論

貴州釀酒的歷史悠久，糯小麥具有良好的釀酒特性，但是貴州省內(nèi)缺乏具有推廣價值的糯性小麥，省外引進(jìn)的糯質(zhì)小麥品種易感條銹病、白粉病和赤霉病等病害，無法適應(yīng)貴州的生態(tài)氣候環(huán)境，因此選育綜合性狀優(yōu)良、產(chǎn)量高的糯性小麥新材料擁有巨大市場前景和科研價值。糯性小麥鑒定方法很多，比如利用半粒種子可以進(jìn)行碘染色檢測，但只能鑒定糯與非糯，無法鑒定部分糯小麥類型。改良的Waxy蛋白SDS－PAGE電泳方法雖簡化了步驟，降低了成本，但Wx－B1和Wx－D1遷移率非常接近，仍難以區(qū)分，且該方法需要破壞種子，在大量篩選和分離后代檢測中的應(yīng)用也受到限制。Wx－A1b、Wx－B1b和Wx－D1b都是隱性基因，利用傳統(tǒng)育種通常需要較長的育種年限；并且當(dāng)只有1～2個隱性基因存在時，即使純合體也很難根據(jù)表型對其進(jìn)行直接選擇。因此，分子標(biāo)記輔助選擇是培育不同支鏈淀粉含量小麥品種的最有效方法。

近年來，根據(jù)Wx基因的已知序列，相繼開發(fā)出了3個位點的分子標(biāo)記［7－11］和這些分子標(biāo)記在基因型鑒定中具有快速、準(zhǔn)確和簡單等諸多優(yōu)點，在植株整個發(fā)育時期和任何部位均可取材檢測。段軍［12］利用糯質(zhì)基因分子標(biāo)記鑒定出12個株系的全糯藍(lán)粒小麥；馬紅勃［13］以揚麥17（紅皮）和揚麥01－2（白皮）2個背景的wx基因近等基因系，對不同遺傳背景和栽培環(huán)境下材料的品質(zhì)特性進(jìn)行了研究；許立奎等［14］利用多重PCR技術(shù)鑒定F2代群體內(nèi)的糯質(zhì)基因；楊芳萍等［15］利用糯質(zhì)基因分子標(biāo)記對甘肅小麥糯質(zhì)蛋白分布進(jìn)行研究，結(jié)果表明Wx－B1b基因從西向東南部逐漸降低；普布卓瑪［16］通過雜交、回交以及自交等方法將3個糯蛋白缺失基因聚合在一個小麥遺傳背景中。

本研究利用糯質(zhì)基因特異分子標(biāo)記，在F2代分離群體內(nèi)發(fā)現(xiàn)單個缺失Wx基因材料的數(shù)目依次為Wx－D1a最 多、Wx－B1a 其 次、Wx－A1a 最 少，但 是 未能發(fā)現(xiàn)同時缺失3個Wx基因的全糯質(zhì)小麥株系，這應(yīng)該與分離群體較小有關(guān)。根據(jù)孟德爾分離定律，位于不同染色體上3個等位基因（Aa／Bb／Dd）的分離情況中，3個隱形等位基因同時出現(xiàn)的頻率為1.56%（1／64）。由于F2代分離群體只有56個，3個隱形基因同時出現(xiàn)的理論值應(yīng)該等于0.875，所以在群體中沒有檢測到同時缺失3個Wx基因的株系也屬正常。理論上1 000個F2代群體只能獲得16株全糯小麥，如果還需要考慮抗病和高產(chǎn)等其他性狀，F(xiàn)2代群體還需要進(jìn)一步增加。因此，為了選育具有較好綜合性狀的抗病全糯質(zhì)小麥，需要擴(kuò)大候選群體大?。ǎ? 000），或者利用部分糯性小麥品系間的雜交，比如F2代群體內(nèi)單缺失wx－A1a的5個單株與缺失wx－B1a＋wx－D1a的11個單株雜家，再利用回交、聚合雜交等方法提高全糯質(zhì)小麥的選育效率。

4 結(jié) 論

本次實驗采用自育品系0117和俞糯麥作為親本，對他們的雜交后代利用Wx基因分子標(biāo)記篩選糯質(zhì)小麥。在顯著水平p＞0.05時，3個糯質(zhì)基因在F2代中的分離比例符合預(yù)期比例，并檢出了不同Wx基因組合的小麥單株，但是未能檢測出3個基因都缺失的全糯質(zhì)小麥單株。本研究結(jié)果表明，在生產(chǎn)實踐中利用標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，結(jié)合傳統(tǒng)的育種經(jīng)驗，可以加快貴州省高產(chǎn)、糯質(zhì)小麥的創(chuàng)新及應(yīng)用。

［1］Murai J，Taira T，Ohta D.Isolation and characterization of the three Waxy genes encoding the granule－bound starch synthase in hexaploid wheat［J］.Gene，1999，234（1）：71－79.

［2］Nakamura T，Yamamori M，Hirano H，Hidaka S，Nagamine T..Production of waxy（amylose－free）wheats［J］.Molecular Genetics and Genomics，1995，248（3）：253－259.

［3］趙國君，徐智斌，馮波，等.糯小麥的釀酒特性研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，46（6）：1 127－1 135.

［4］舒守貴，王濤.利用回交法與Wx基因分子標(biāo)記輔助選擇培育糯性小麥［J］.遺傳，2006，28（5）：563－570.

［5］張晶，張曉科，梁強，等.基于173份小麥評價糯蛋白亞基基因（Wx）的分子標(biāo)記和構(gòu)建其多重PCR體系［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2011，19（3）：417－426.

［6］王亮，穆培源，徐紅軍，等.新疆小麥品種Wx基因組成及其淀粉糊化特性研究［J］.麥類作物學(xué)報，2010，30（6）：1 017－1 022.

［7］Nakamura T，Vrinten P，Saito M，Konda M.Rapid classification of partial waxy wheat using PCR－based markers［J］.Genome，2002，45（6）：1 150－1 156.

［8］劉迎春，朱惠蘭，程順和，等.小麥 Wx－A1和 Wx－D1位點的PCR分子標(biāo)記［J］.麥類作物學(xué)報，2005，25（1）：1－5.

［9］Dellaporta SL，Wood J，Hicks JB.A plant DNA mini－preparation：Version II［J］.Plant Molecular Biology Reporter，1983，1（4）：19－21.

［10］Shariflou MR，Sharp PJ.A polymorphic microsatellite in the 3’end of‘waxy’genes of wheat，Triticum aestivum［J］.Plant Breeding，1999，118（3）：275－277.

［11］Shariflou MR，Hassani ME，Sharp PJ.A PCR－based DNA marker for detection of mutant and normal alleles of the Wx－D1gene wheat［J］.Plant Breeding，2001，120（120）：121－124.

［12］段軍.藍(lán)糯小麥資源篩選及農(nóng)藝性狀分析［D］.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

［13］馬紅勃.小麥wx基因近等基因系的評價及品質(zhì)特性研究［D］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

［14］許立奎，潘彬榮，岳高紅，等.抗白粉病糯性小麥的多重PCR分子鑒定技術(shù)［J］.核農(nóng)學(xué)報，2014，28（7）：1 203－1 207.

［15］楊芳萍，楊莉，郭瑩，等.甘肅小麥品種（系）面筋強度和糯蛋白基因分布規(guī)律研究［J］.麥類作物學(xué)報，2015，35（7）：933－939.

［16］普布卓瑪.利用分子育種選育西藏糯小麥［J］.西藏農(nóng)業(yè)科技，2015（4）：36－40.