劉 麗，楊紅梅，劉惠文，尹 東，王天鵬，封 靜，袁曉超，俞海龍

在我國(guó)發(fā)病率逾為70%[1]的牙周炎疾病其主要病理變化是牙槽骨的吸收，從而加速了牙齒的松動(dòng)脫落,基礎(chǔ)治療和手術(shù)不能完全控制病情遷延[2]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者在不同領(lǐng)域?qū)Ω什莸难芯勘砻?，甘草具有抗菌、抗病毒、?zhèn)咳、抗癌、增強(qiáng)免疫力及促進(jìn)骨的重建和代謝等諸多活性[3]。骨堿性磷酸酶(BALP)出現(xiàn)于骨基質(zhì)成熟期，是骨形成中期指標(biāo)，是成骨細(xì)胞膜上的一種蛋白，在骨形成及骨礦化過(guò)程中起很重要的作用。BALP在血中的濃度能反映骨形成的速率[4]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP-4)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β超家族成員之一，它在成骨細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、分化過(guò)程中具有誘導(dǎo)活性，進(jìn)而加速破壞骨的修復(fù)重建，在骨形成初期具有極為關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[5]。本研究將通過(guò)局部結(jié)扎絲刺激聯(lián)合黏結(jié)牙石加混合菌感染大鼠牙周并高糖飲食的方法建立大鼠牙周炎模型[6]，然后對(duì)模型給予甘草液干預(yù)，并通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)建模前，建模后以及甘草水煎液干預(yù)模型后大鼠血清中骨代謝指標(biāo)BALP、BMP-4進(jìn)行檢測(cè)分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選用清潔二級(jí)10周齡SD大鼠，雄性，體重(230±20)g。

1.2 藥物及儀器：甘草飲片(購(gòu)自寧夏古方中醫(yī)藥品超市)和蒸餾水1∶10(W∶V)混合，沸水回流5 h，濾渣后收集提取液。試劑：BALP和BMP-4酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)。儀器為分光儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法： ①將30只體重220～260 g雄性8周齡清潔級(jí)大鼠全部斷尾取血1 mL并標(biāo)記為第1組血樣，將其全部離心取上清液-80 ℃保存。②隨后將30只大鼠分為建模組26只和陰性對(duì)照組4只。建模組大鼠經(jīng)10 g/L戊巴比妥3 mg/kg腹腔注射麻醉、固定。采用0.2 mm正畸用結(jié)扎絲結(jié)扎SD大鼠右側(cè)上下頜磨牙牙頸部1圈，于頰側(cè)擰緊，將結(jié)扎頭置于牙齦溝內(nèi)。此后將重度牙周病患者牙石碾碎，與其齦溝液混合刺入右側(cè)上下頜磨牙頰舌側(cè)牙齦，深度4 mm，并注滿齦溝。以自身對(duì)側(cè)同名牙作為正常對(duì)照，禁食水0.5 h。陰性對(duì)照組大鼠不做處理。③建模組大鼠給予高糖飲食喂養(yǎng)，陰性對(duì)照組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)，每日檢查并記錄，持續(xù)14 d。④建模組大鼠第14天出現(xiàn)右側(cè)磨牙區(qū)牙齦組織紅腫、觸之出血、磨牙松動(dòng)、牙周袋逐漸形成并加深、牙根暴露等牙周炎現(xiàn)象，而陰性對(duì)照組則沒(méi)有明顯變化。⑤第15天將29只大鼠(建模組死亡1只)斷尾取血1 mL，標(biāo)記為第2組血樣，離心取上清-80 ℃保存。⑥將建模好的25只牙周炎大鼠模型分出19只為藥物實(shí)驗(yàn)組，按600 mg/kg灌胃；另外6只為藥物對(duì)照組，給予等體積生理鹽水灌胃，均為每天1次，持續(xù)30 d。⑦陰性對(duì)照組4只大鼠，繼續(xù)給予適應(yīng)性喂養(yǎng)。⑧在第46天第3次對(duì)28只大鼠(藥物實(shí)驗(yàn)組死亡1只)心臟取血1 mL，并標(biāo)記為第3組血樣，離心取上清-80 ℃保存。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)：將3組大鼠血清對(duì)應(yīng)標(biāo)號(hào)，酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清中BALP、BMP-4。各程序按試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 大鼠牙槽骨吸收模型的評(píng)價(jià)：空白對(duì)照組大鼠口腔組織表現(xiàn)正常，牙齦無(wú)紅腫、無(wú)牙周袋、無(wú)牙根暴露等。模型組大鼠第14天出現(xiàn)右側(cè)磨牙區(qū)牙齦組織紅腫，觸之出血，磨牙松動(dòng)，牙周袋逐漸形成并加深，牙根暴露現(xiàn)象明顯。

2.2 血清BALP、BMP-4濃度測(cè)定：第3組血樣建模組血清標(biāo)本中BALP以及BMP-4濃度均高于第1、第2組血樣濃度(P<0.05),第3組血樣建模組血清標(biāo)本中BALP以及BMP-4濃度高于藥物對(duì)照組及陰性對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表1-表2。

表1 3組大鼠血清標(biāo)本中BALP濃度的比較

表2 各組大鼠血清標(biāo)本中BMP-4濃度

3 討論

牙周炎是多因素引起的牙周支持組織的慢性炎癥，發(fā)病率高，伴隨其病變發(fā)展可誘發(fā)其他多系統(tǒng)發(fā)生病變，是危害人類健康的重要疾病之一。目前臨床主要以牙周基礎(chǔ)治療為主，它僅能控制病變進(jìn)展，對(duì)牙槽骨骨組織流失不能很好控制及逆轉(zhuǎn)[7]。因此，對(duì)牙周炎治療新策略的研發(fā)利用至關(guān)重要。血中骨代謝標(biāo)志物水平檢測(cè)是一種無(wú)創(chuàng)快速、靈敏和動(dòng)態(tài)反映骨轉(zhuǎn)換變化，對(duì)代謝性骨病的診斷、治療以及在評(píng)價(jià)藥物治療效果中有不可替代的作用[8]。

本研究結(jié)果顯示，在大鼠牙周炎模型建立前，所有血清中顯示30只大鼠BALP、BMP-4之間的變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而第2組血清中顯示BALP、BMP-4在陽(yáng)性建模組中有較小的變化，但是數(shù)值高低沒(méi)有明確的一致性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析原因可能是BALP、BMP-4在牙周炎模型中，由于在炎癥刺激下，破骨細(xì)胞因子增加，而成骨細(xì)胞因子處于代償性的對(duì)抗?fàn)顟B(tài)，則表現(xiàn)出少量的改變，再加上個(gè)體之間的差異，從而反應(yīng)出不明確的變化。而陰性對(duì)照組與對(duì)應(yīng)的第1組相比沒(méi)有變化，結(jié)果可以體現(xiàn)出建模的成功及對(duì)大鼠BALP、BMP-4的影響。

而在第3組血清檢測(cè)中，BALP、BMP-4有明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，陰性對(duì)照組與第2組沒(méi)有明顯的變化，這充分證明了在甘草水煎液對(duì)大鼠牙周炎模型中骨吸收后又增殖的過(guò)程發(fā)揮了明確的促進(jìn)作用。分析可能是甘草有效成分促進(jìn)BALP及BMP-4的分泌，從而可以誘導(dǎo)未分化的間葉細(xì)胞向骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。劉珊等研究顯示，甘草液能抑制炎癥造成的破骨細(xì)胞通路的激活，抑制骨的再吸收[9]；李明慧等研究顯示甘草附子湯通過(guò)下調(diào)破骨細(xì)胞組織蛋白酶K(Cath K)的表達(dá)來(lái)抑制去卵巢大鼠骨組織中成骨細(xì)胞I型膠原(Col I)蛋白的降解，增加骨小梁的數(shù)量，改善骨小梁的結(jié)構(gòu)，減低骨的轉(zhuǎn)換率，從而達(dá)到甘草附子湯對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松預(yù)防的目的[10]。

Mattarello MJ等研究顯示，甘草酸能增加甲狀旁腺激素的水平，從而調(diào)整骨代謝[11]；Choi EM等研究顯示，甘草酸可以增加小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3-E1的活性，以及ECM骨信號(hào)傳導(dǎo)通路[12]；Sasaki H等研究顯示，甘草液還可以抑制在缺乏IL-10所造成的大鼠牙周炎模型中NF-κb的轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制骨吸收的信號(hào)通路[13]；Somjen D等研究顯示甘草液可以促進(jìn)雌激素的活性，從而促進(jìn)骨細(xì)胞的增殖[14]。通過(guò)國(guó)內(nèi)外研究分析，甘草液可以通過(guò)多種途徑調(diào)整骨代謝，促進(jìn)骨細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果與這些結(jié)論相一致。

綜上所述,通過(guò)本實(shí)驗(yàn)證實(shí)甘草水提液能促進(jìn)大鼠實(shí)驗(yàn)性牙槽骨吸收后骨再生轉(zhuǎn)化因子BALP、BMP-4的增殖，從而為進(jìn)一步研制治療牙周炎牙槽骨骨吸收的中藥奠定了理論基礎(chǔ)。甘草到目前已分析出300多種有效成分，具體哪種成分對(duì)牙槽骨的細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用還有待進(jìn)一步研究。

[1] Silva N，Abusleme L，Bravo D，et al.Host response mechanisms in periodontal diseases[J].Journal of Applied Oral Science，2015，23(3):329-355.

[2] Shankar Ram V，Parthiban，Uma Sudhakar，et al.Bonebiomarkers in Periodontal Disease:A Review Article[J].Clin Diagn Res，2015，9(1):7-10.

[3] Jung JC，Lee Yunhee，Kim SH，et al.Hepatoprotective effect of licorice，the root of Glycyrrhiza uralensis Fischer，in alcohol-induced fatty liver disease[J].BMC Complementary and Alternative Medicine，2016，16(16):19.

[4] Yue Song，Hao Tan，Kejian Liu，et al.Effect of fluoride exposure on bone metabolism indicators ALP，BALP and BGP[J].Environ Health Prev Med，2011 ,16(3):158-163.

[5] 孫偉方，王曄愷，劉曉光，等.血清骨形成蛋白-4水平與異位骨化的關(guān)系研究[J].中醫(yī)正骨，2012，24(6)：37-41.

[6] 張艷，孫漢堂，汪平，等.對(duì)大鼠牙周炎模型中骨吸收的誘導(dǎo)與自然轉(zhuǎn)歸情況的觀察[J].牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2013，5：294-297.

[7] 吳賈涵，楊萍，李紹岳，等.補(bǔ)腎固齒丸輔助牙周基礎(chǔ)治療的牙槽骨改變的研究[J].全科口腔醫(yī)學(xué)電子雜志，2015，1：81-84.

[8] 李士紅，劉陽(yáng).骨關(guān)節(jié)病變及骨折患者圍術(shù)期骨代謝標(biāo)志物檢測(cè)及骨密度變化[J].中國(guó)組織工程研究，2016，20(35)：5290-5295.

[9] 劉珊.異甘草素經(jīng)自噬途徑抑制破骨細(xì)胞功能及機(jī)制[D].武漢：武漢大學(xué)，2016.

[10] 李明慧，王桂敏.甘草附子湯對(duì)去卵巢大鼠骨組織中Ⅰ型膠原代謝及組織蛋白酶K表達(dá)的影響[J].中國(guó)生化藥物雜志，2011，32(5)：356-359.

[11] Mattarello M，Benedini S，F(xiàn)iore C，et al.Effect of licorice on PTH levels in healthy women[J].Steroids，2006，71(5):403-408.

[12] Chol EM.Liquiritigenin isolated from Glycyrrhiza uralensis stimulates osteoblast function in osteoblastic MC3T3-E1 cells[J].International Immunopharmacology，2012，12(1):139-143.

[13] Sasaki H，Suzuki N，Alshwaimi E，et al.18 beta-Glycyrrhetinic acid inhibits periodontitis via glucocorticoid-independent nuclear factor-kappa B inactivation in interleukin 10 deficient mice[J].Journal of Periodontal Research，2010，45(6):757-763.

[14] Somjen D，Katzburg S，Vaya J，et al.Estrogenic activity of glabridin and glabrene from licorice roots on human osteoblasts and prepubertal rat skeletal tissues[J].Steroid Biochem Mol Biol，2004，91(4/5):241-246.