王夢(mèng)影， 黃國(guó)偉， 程 曼， 董志萍， 張緒梅

自噬(autophagy)是一種通過(guò)隔離膜包裹細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器來(lái)形成自噬體，再與溶酶體、微管系統(tǒng)等融合形成自噬溶酶體來(lái)降解包裹物質(zhì)的一種高度保守的細(xì)胞降解途徑[1]。因其與多種生理病理過(guò)程相關(guān)聯(lián)，現(xiàn)已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。自噬是一個(gè)自我消化的過(guò)程，在能量調(diào)控和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)刺激的反應(yīng)調(diào)控扮演重要角色[2]。一般正常生理?xiàng)l件下，自噬維持基礎(chǔ)水平，在營(yíng)養(yǎng)缺乏、氧化應(yīng)激、缺氧等狀況下，自噬水平會(huì)提高[3]。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)是指一類(lèi)具有自我更新能力和高增殖、多分化潛能，可分化為神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞群[4]。目前NSCs的體外培養(yǎng)方法主要有細(xì)胞球懸浮法(懸浮培養(yǎng))和單層貼壁培養(yǎng)法(貼壁培養(yǎng))，以懸浮培養(yǎng)最為常見(jiàn)，其操作簡(jiǎn)單且可獲得大量NSCs，但卻存在一定缺陷，如細(xì)胞球內(nèi)部的細(xì)胞會(huì)因接觸不到營(yíng)養(yǎng)因子而死亡。而單層貼壁培養(yǎng)大大增加了細(xì)胞的暴露面積，有利于神經(jīng)干細(xì)胞充分獲取細(xì)胞因子刺激長(zhǎng)期穩(wěn)定增殖[5]，但卻存在易導(dǎo)致NSCs分化的缺陷。國(guó)內(nèi)外已有文獻(xiàn)報(bào)道神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)存在自噬現(xiàn)象[6]。但大多是對(duì)NSCs單一培養(yǎng)方式的自噬觀察，而對(duì)進(jìn)行不同培養(yǎng)方式之間自噬水平的對(duì)比研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬采用懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)來(lái)檢測(cè)NSCs體外培養(yǎng)過(guò)程中自噬的發(fā)生情況，并比較兩組自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1的表達(dá)水平，同時(shí)，希望能在培養(yǎng)方式的選擇上提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 出生24 h內(nèi)的SD大鼠，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 藥品與試劑 DMEM/F-12(1∶1)培養(yǎng)基(康寧公司，貨號(hào)：10-092-CVR)，B27(GIBCO公司，貨號(hào)：17504-044)，堿性成纖維生長(zhǎng)因子和表皮生長(zhǎng)因子(PEPROTECH公司，貨號(hào)：106096-93-9、102400-25-20)，鼠抗大鼠巢蛋白抗體(Nestin)(Abcam公司，貨號(hào)：ab6142)，兔抗大鼠Beclin-1和兔抗大鼠LC3B抗體(CST公司，貨號(hào)：#3495、#3868)，山羊抗鼠H&L IgG(Abcam公司，貨號(hào)：ab150115),辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔(CST公司，貨號(hào)：#7074)，40×檸檬酸鈉-依地酸(乙二胺四乙酸， ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗原修復(fù)液及抗熒光淬滅封片劑(碧云天生物)，即用型山羊血清和二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA) 蛋白定量試劑盒(博士德生物)，其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 NSCs原代培養(yǎng)

1.3.1 細(xì)胞球懸浮培養(yǎng) 新生24 h以?xún)?nèi)的SD大鼠，無(wú)菌條件下取SD大鼠海馬與紋狀體組織，放入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)，再用培養(yǎng)液洗兩次替換PBS，將組織塊剪溶成約1 mm3的小塊，用1000 ml槍頭吹打數(shù)次，獲得細(xì)胞懸液，過(guò)細(xì)胞篩(0.76 μm)。將細(xì)胞懸液離心800 r/min×5 min，去除上清液，加入培養(yǎng)基(DMDM/F12、EGF20 ng/ml、 bFGF10 ng/ml、L-谷氨酰胺2 mol/L、2%B27、青霉素和鏈霉素100 U/ml、葉酸10 μmol/L)，吹打混勻，以臺(tái)盼藍(lán)法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按 1～2×106個(gè)/ml 接種于培養(yǎng)瓶。置 37 ℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)，3 d后神經(jīng)球形成。

1.3.2 單層貼壁培養(yǎng) 單層貼壁培養(yǎng)的SD大鼠的分離方法同懸浮培養(yǎng)分離方法，其不同是需提前4 h用0.01 g/L多聚鳥(niǎo)氨酸和2 g/L明膠包被25 cm2的培養(yǎng)瓶，以2×106個(gè)/ml接種，隔天換液一次，顯微鏡下觀察及拍照。

1.4 NSCs的鑒定 懸浮培養(yǎng)的神經(jīng)球機(jī)械吹打后，以1～2×106個(gè)/ ml接種在包被laminin的圓玻片上，單層貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)0.125%胰酶消化后計(jì)數(shù)，以1～2×106個(gè)/ml接種在laminin包被的圓玻片上，放入24孔板，加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h后進(jìn)行免疫熒光染色。4%多聚甲醛固定，PBS洗3次，山羊血清室溫封閉1 h，加入一抗Nestin(1∶100)4 ℃過(guò)夜，分別加二抗(1∶200)，室溫孵育1 h，滴加DAPI覆蓋過(guò)玻片后，避光靜置10 min，0.01 mol/L的PBS洗一次，抗熒光淬滅劑封片，熒光倒置顯微鏡下觀察及拍照。

1.5 電鏡切片制備與觀察 取原代培養(yǎng)5 d的NSCs，置于1.5 ml離心管中1000 r/min，離心5 min后棄上清，加入2.5%戊二醛4 ℃固定過(guò)夜。再用1%鋨酸固定1 h。PBS漂洗兩次后，常規(guī)梯度乙醇及100%丙酮逐級(jí)脫水。環(huán)氧樹(shù)脂浸透、包埋。超薄切片后經(jīng)鉛鈾雙染，在透射電子顯微鏡(HT-7700；Hitachi)下觀察并拍照。

1.6 Western blotting 將原代培養(yǎng)5 d的NSCs中加入RIPA裂解液置于冰盒上進(jìn)行裂解，4 ℃高速離心機(jī)去除細(xì)胞碎片，并用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度。用上樣緩沖液調(diào)整每組樣品濃度，使各組樣品濃度保持一致，煮沸10 min。配制15%的分離膠和5%的濃縮膠，加樣10 μg每孔。在140 V條件下，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)100 min后，從膠上轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜用5%的脫脂奶粉室溫封閉120 min，分別加入一抗LC3B(1∶1000)，Beclin1(1∶800)，β-actin(1∶2000)，4 ℃孵育14 h，TBST漂洗后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2000)，室溫孵育1 h，TBST充分漂洗后顯影，拍照保存圖片，蛋白條帶用Image J 2.0軟件進(jìn)行定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 顯微鏡下大鼠原代NSCs形態(tài)學(xué)特征及鑒定 原代培養(yǎng)開(kāi)始階段，懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞多成單個(gè)或十幾個(gè)細(xì)胞聚集成球，為具有良好折光性的圓形小球，隨培養(yǎng)天數(shù)的增加細(xì)胞球的直徑逐漸增大，中心部細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)不良而呈棕褐色(見(jiàn)圖1A)。貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞呈單層生長(zhǎng)無(wú)壞死棕褐色存在(見(jiàn)圖1B)，形態(tài)多成兩極或三極，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增多及時(shí)添加新的培養(yǎng)液細(xì)胞數(shù)量明顯增多。懸浮培養(yǎng)原代神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物Nestin免疫熒光染色結(jié)果(見(jiàn)圖2A)，DAPI染核(見(jiàn)圖2B)，細(xì)胞陽(yáng)性率(呈紅色)約為95%(見(jiàn)圖2C)。貼壁培養(yǎng)培養(yǎng)原代神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物Nestin免疫熒光染色結(jié)果(見(jiàn)圖2D)，DAPI染核(見(jiàn)圖2E)，細(xì)胞陽(yáng)性率接近100%(見(jiàn)圖2F)。

2.2 透射電鏡下兩組NSCs中自噬小體的觀察比較 單層貼壁培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞核膜清晰完整，染色質(zhì)呈細(xì)顆粒狀，線(xiàn)粒體脊發(fā)達(dá)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)散在分布，可見(jiàn)大量游離核糖體(見(jiàn)圖3A)。細(xì)胞球懸浮培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞，染色質(zhì)呈團(tuán)塊狀分布在核膜周?chē)€(xiàn)粒體腫脹，脊斷裂，球形線(xiàn)粒體較多，游離核糖體減少明顯，可見(jiàn)由雙層膜或多層膜結(jié)構(gòu)(即自噬小體)，包裹的吞噬物為降解的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞器,或與溶酶體融合形成自噬溶酶體(見(jiàn)圖3B)。

2.3 Western blotting檢測(cè)兩組NSCs中LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)變化 LC3、Beclin-1分別作為酵母菌(Atg7/Atg8、Atg6)在哺乳動(dòng)物的同源物，參與自噬體的形成。且在自噬體形成時(shí)LC3Ⅰ與磷酸酰乙醇胺共軛轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3Ⅱ，因此常用LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin-1作為自噬標(biāo)記物。LC3蛋白結(jié)果顯示，與貼壁培養(yǎng)相比，懸浮培養(yǎng)LC3的蛋白表達(dá)量顯著增多(見(jiàn)圖4A)，且LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖4B)。Beclin-1蛋白結(jié)果顯示，與貼壁培養(yǎng)相比，懸浮培養(yǎng)Beclin-1的蛋白表達(dá)量顯著增多(見(jiàn)圖4C)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖4D)。

A：懸浮培養(yǎng)；B：貼壁培養(yǎng)；標(biāo)尺=100 μm

紅色：Nestin；藍(lán)色：DAPI；藍(lán)粉色：DAPI與Nestin共標(biāo)；A～C：懸浮培養(yǎng)；D～F：貼壁培養(yǎng)；標(biāo)尺=50 μm

圖2 大鼠原代NSCs的Nestin鑒定

→自噬小體；▲自噬溶酶體；A：貼壁培養(yǎng)；B：懸浮培養(yǎng)；標(biāo)尺=1 μm

圖3 透射電鏡下兩組自噬小體的比較

a：LC3Ⅱ的蛋白表達(dá)； B：LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的統(tǒng)計(jì)分析； C：Beclin-1的蛋白表達(dá)； D：Beclin-1的統(tǒng)計(jì)分析(與貼壁培養(yǎng)比較*P<0.05，**P<0.05，n=3)

圖4 Western blotting檢測(cè)LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白在兩組NSCs中的表達(dá)

3 討 論

自20世紀(jì)90年代初，Reynolds等在胚胎鼠腦組織和成年鼠分離出了NSCs，經(jīng)過(guò)二十幾年的探索，使體外培養(yǎng)NSCs移植入機(jī)體，恢復(fù)受損的神經(jīng)功能有望成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新方法?，F(xiàn)已有較為成熟的懸浮培養(yǎng)大鼠海馬原代NSCs的方法，近來(lái)又發(fā)現(xiàn)貼壁培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的方法有著懸浮培養(yǎng)不可替代的優(yōu)點(diǎn)[7,8]。本實(shí)驗(yàn)采用懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)兩種方法，通過(guò)懸浮細(xì)胞球直徑的變大，貼壁細(xì)胞密度的增加均可以說(shuō)明神經(jīng)干細(xì)胞的增殖特性，與此同時(shí)，所培養(yǎng)的細(xì)胞均表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞的特異性標(biāo)記物Nestin(即神經(jīng)上皮干細(xì)胞樣蛋白，是一種第Ⅵ類(lèi)中間絲蛋白)，代表我們分離得到的是具有自我更新能力的神經(jīng)干細(xì)胞。

自噬是一種程序化降解自身大分子物質(zhì)及受損細(xì)胞器的過(guò)程，其對(duì)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、對(duì)外界環(huán)境的刺激應(yīng)答等具有重要作用。有研究表明，NSCs在缺氧、營(yíng)養(yǎng)匱乏和炎性反應(yīng)等應(yīng)激條件下，NSCs微環(huán)境將產(chǎn)生活性氧簇、活性氮等，從而產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致細(xì)胞器，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線(xiàn)粒體功能損傷[9]。也有研究顯示，自噬在及時(shí)清除損傷的細(xì)胞器，維持細(xì)胞功能正常、細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，延緩衰老和死亡等具有重要作用[10]。而自噬作為一種適應(yīng)性降解途徑，可以應(yīng)答生長(zhǎng)因子缺乏、缺氧和營(yíng)養(yǎng)匱乏等代謝應(yīng)激，通過(guò)分解釋放代謝產(chǎn)物，保證其順利進(jìn)入三羧酸循環(huán)進(jìn)行能量的供應(yīng)[9]。由此可見(jiàn)，自噬是一把雙刃劍。檢測(cè)自噬的金標(biāo)準(zhǔn)就是電鏡下觀察到自噬體的存在，激活自噬的同時(shí)，ULK復(fù)合物與PI3K(the phosphatidylinositol 3-kinase)復(fù)合物形成雙層隔膜包裹待吞噬物，形成自噬小體[11]。自噬小體的形成與多種蛋白的表達(dá)水平的改變有關(guān)，如LC3、Beclin-1、P62蛋白等。LC3作為自噬相關(guān)基因受自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene)家族調(diào)控，其為酵母自噬基因(Atg7/Atg8)在哺乳動(dòng)物的同源物。LC3Ⅰ是自噬體膜上的一種標(biāo)志物，在自噬形成時(shí)，LC3Ⅰ與磷酸酰乙醇胺共軛轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3Ⅱ，且LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值、LC3Ⅱ均與自噬小體形成程度直接相關(guān)，因此常作為自噬形成的標(biāo)記物。Beclin-1作為酵母菌Atg6的同源物，參與自噬前體和自噬小體的形成過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Western blotting方法檢測(cè)了LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)，且在電鏡下觀察到了懸浮培養(yǎng)組中有自噬小體的存在，且有自噬小體與溶酶體結(jié)合降解包裹物，即自噬溶酶體(晚期自噬體)的存在。至此，我們分別在分子水平和超微結(jié)構(gòu)水平驗(yàn)證了懸浮培養(yǎng)與貼壁培養(yǎng)相比，前者的自噬發(fā)生水平顯著高于后者，推測(cè)其可能原因?yàn)榧?xì)胞球內(nèi)部與培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分、氧氣接觸不良而激活自噬，本實(shí)驗(yàn)已證實(shí)與貼壁培養(yǎng)相比，懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞可提高LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)，激活細(xì)胞內(nèi)自噬，但懸浮細(xì)胞球內(nèi)是如何調(diào)控LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)差異及自噬是否處于保護(hù)水平仍需進(jìn)一步研究。

NSCs因?yàn)榧?xì)胞球內(nèi)存在細(xì)胞死亡的現(xiàn)象[12]。同時(shí)，懸浮培養(yǎng)不易于NSCs的形態(tài)學(xué)觀察和生物特性的分析，如流式細(xì)胞儀、電生理等[13]。在進(jìn)行細(xì)胞傳代時(shí)，為將其分成單個(gè)細(xì)胞而對(duì)其進(jìn)行機(jī)械吹打和胰酶消化等刺激使細(xì)胞活力下降。即使如此懸浮培養(yǎng)仍然作為NSCs的主要培養(yǎng)方式，因?yàn)榇朔ú僮骱?jiǎn)單，易獲得大量NSCs，且同時(shí)保持良好的增殖特性。也有部分學(xué)者嘗試用貼壁培養(yǎng)的方法來(lái)獲得純度較高的NSCs，此舉解決了NSCs與培養(yǎng)基接觸不充分而造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換困難的問(wèn)題，同時(shí)貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞可以細(xì)致的觀察單個(gè)細(xì)胞的生物學(xué)特性，不容忽視的是貼壁培養(yǎng)存在不易控制的缺陷，容易造成NSCs的貼壁分化[14]。因此本研究希望通過(guò)對(duì)不同培養(yǎng)方式中自噬的比較，在NSCs培養(yǎng)方式的選擇上提供參考。

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