朱 莉,郭 佳,譚 平

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 呼吸科，吉林 長(zhǎng)春130033)

肺癌是人類最常見(jiàn)的死亡原因之一[1]，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是最普遍的肺癌類型，占總體肺癌病例的80%-85%，因早期特異性臨床癥狀較少，NSCLC患者臨床確診時(shí)常已進(jìn)展至腫瘤晚期階段，此階段多數(shù)患者治療效果有限，5年生存率約14%。微小RNA(miRNA)是一種小的非編碼單鏈RNA，可在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，具體調(diào)控機(jī)制為結(jié)合靶mRNA的3'-UTR(3'-非編碼區(qū)域)[2]，在肺癌的診斷、治療及其耐藥性發(fā)生等多個(gè)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，通過(guò)深入研究miRNA與肺癌關(guān)系，有望提高未來(lái)肺癌診斷的靈敏度和特異性[3，4]。

1 miRNA的生物過(guò)程及功能

miRNA是一種內(nèi)源性單鏈非編碼的小RNA分子，由19-22個(gè)核苷酸組，可通過(guò)對(duì)mRNA轉(zhuǎn)錄后水平識(shí)別和影響，進(jìn)而產(chǎn)生基因調(diào)節(jié)、動(dòng)植物細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)節(jié)等作用[5，6]，并可調(diào)控50%以上的人類蛋白編碼基因[7]。miRNA的前體為大約70個(gè)核苷酸(nt)大小的RNA分子，可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，此前體在多種酶(RNA聚合酶II、RNaseIII家族中的Drosha、Dicer等)的作用下逐步產(chǎn)生初級(jí)前體(可大于1kb的長(zhǎng)片段)、發(fā)卡狀前體(pre-miRNA，長(zhǎng)約65nt)、及長(zhǎng)約22nt的雙鏈RNA[8]。雙鏈RNA中的一條鏈被降解，而另一條鏈則轉(zhuǎn)化為成熟的miRNA。成熟的miRNA主要通過(guò)與靶基因3’端UTR堿基配對(duì)(完全或不完全)，而對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)功能發(fā)揮控制作用[9-11]。根據(jù)miRNA的功能可將其大致分為兩類，一些miRNA具有促癌基因的特性，其高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，另一些miRNA具有抑癌基因的特性，抑制其表達(dá)會(huì)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[12]。Let-7是一種抑癌基因，它可通過(guò)抑制致癌基因、調(diào)控有絲分裂相關(guān)基因(如：RAS，MYC，HMGA2等)發(fā)揮作用[13]，同時(shí)有助于對(duì)腺癌(adenocarcinoma，AD)和鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)進(jìn)行病理分型[14]。

2 miRNA與NSCLC的診斷

miRNA可為NSCLC患者提供無(wú)創(chuàng)性診斷方法。經(jīng)過(guò)福爾馬林固定和石蠟包埋之后的標(biāo)本中依然可以有效地提取和評(píng)估m(xù)iRNA[15]，除病變組織外，miRNA也存在于人體各種體液中，包括血清、血漿、唾液、尿液、乳汁、腦脊液及精液[16-18]，有學(xué)者已在NSCLC患者的支氣管肺泡灌洗液[19,20]、胸腔積液[21,22]及血液/血漿/血清[7，18，23]中找到了腫瘤相關(guān)的miRNA，推動(dòng)了以細(xì)胞外核酸為基礎(chǔ)的新型非侵入性檢查方法的發(fā)展。

2012年，Roa等人[24]選取痰液中5種miRNA(miR-21，miR-143，miR-155，miR-210，miR-372)進(jìn)行層序聚類分析發(fā)現(xiàn)這5種miRNA可用于檢測(cè)NSCLC患者(83.3%敏感性和100%特異性)，2015年，Kim等人[25]再次驗(yàn)證這5種miRNA表達(dá)水平在NSCLC患者與健康對(duì)照者痰樣品之間存在差異(100%敏感性和83.3%特異性)。2016年，Razzak等[26]對(duì)NSCLC患者痰液檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，mir-21，mir-210和mir-372可用于NSCLC患者早期診斷(67%敏感性和90%特異性)，其對(duì)晚期NSCLC患者也可發(fā)揮重要診斷價(jià)值(敏感性和特異性64%和100%)；2010年，研究者[27]通過(guò)收集早期肺腺癌患者的痰液進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，miR-21，miR-486，miR-375和miR-200b在早期肺腺癌患者痰液中高表達(dá)，聯(lián)合上述4種痰液miRNA可達(dá)到早期肺腺癌檢測(cè)最佳預(yù)測(cè)值(80.6%敏感性，91.7%特異性)；miR-21不僅在NSCLC患者痰液中高表達(dá)，其在外周血中也有明顯升高，提檢外周血 miR-21可用于NSCLC診斷(78.80%敏感性，100.00%特異性)[28]。除miR-21外，NSCLC患者的外周血中存在多種異常表達(dá)的miRNA，Yang等[29]發(fā)現(xiàn)外周血單核細(xì)胞中miR-10b的表達(dá)水平可以區(qū)分NSCLC患者和非腫瘤患者，ROC曲線分析估計(jì)miRNA-10b的峰值診斷靈敏度為86.5%，特異性為76.9%。Lv等[30]發(fā)現(xiàn)miR-146a，miR-222和miR-223在Ⅰ/Ⅱ期肺腺癌患者血清中顯著表達(dá)，可用于肺腺癌的早期診斷；Tian F等[31]通過(guò)18對(duì)配對(duì)血清和18對(duì)配對(duì)組織樣品miRNA測(cè)序發(fā)現(xiàn),在這些配對(duì)的樣品中，miR-181b-5p在鱗狀細(xì)胞癌(SCC)中上調(diào)，在腺癌(AC)中miR-486-5p下調(diào)。NSCLC患者的支氣管肺泡灌洗液中也可發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的miRNA，Schmidt B等[19]發(fā)現(xiàn)，hsa-miR1285、1303、29a-5p及650在支氣管肺泡灌洗樣本中有高表達(dá)。

miRNA從細(xì)胞內(nèi)釋放到體液的機(jī)制包括細(xì)胞死亡(壞死和凋亡)和活動(dòng)性分泌[20]。生化分析顯示存在于血液中的細(xì)胞外miRNA對(duì)RNA酶具有抵抗性，對(duì)PH值及溫度的變化也表現(xiàn)出穩(wěn)定性[16，17]，這和miRNA選擇性包裝(如外分泌體)、與RNA結(jié)合蛋白(如AGO、磷酸蛋白NPM1)或核糖體蛋白結(jié)合有關(guān)[21]。研究顯示[22]，NSCLC患者外泌體miR-21，外泌體miR-21與腫瘤大小和腫瘤-淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(TNM)階段顯著相關(guān)(P<0.05)，高外泌miR-21患者的無(wú)病生存率 DFS)明顯低于低外泌miR-21患者(P<0.05)。Rabinowits等[32]通過(guò)對(duì)比肺腺癌患者與非肺癌患者循環(huán)外分泌體miRNA水平發(fā)現(xiàn)，外分泌體的miRNA特征與原始腫瘤細(xì)胞miRNA的表達(dá)擴(kuò)增相平行。腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外分泌體具有促進(jìn)腫瘤作用并可促進(jìn)癌癥刺激活動(dòng)如增殖、細(xì)胞外基質(zhì)重塑、遷移、侵襲、血管生成和轉(zhuǎn)移等[33]。其表達(dá)水平及擴(kuò)增的變化可作為診斷標(biāo)志物用于早期發(fā)現(xiàn)腫瘤、確定腫瘤類型。

3 miRNA與NSCLC的靶向治療

近20年有大量學(xué)者致力于研究與肺癌靶向治療有關(guān)的基因突變，目前研究較為透徹的包括表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)外顯子19(ex19del)和外顯子21(L858R)突變，二者約占所有NSCLC患者EGFR突變的90%，此外還有棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白樣4(EML-4)-間變性淋巴瘤激酶(ALK)重排[34,35]。 EGFR突變和ALK重排聯(lián)合應(yīng)用可以檢測(cè)到多達(dá)20%的晚期非小細(xì)胞肺癌。重要的是，選擇性酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)已被開(kāi)發(fā)用于治療含有這些靶向基因改變的NSCLCs，例如以EGFR酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域?yàn)榘袠?biāo)的吉非替尼、厄洛替尼和阿法替尼，抑制ALK融合蛋白的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的克唑替尼[36,37]。對(duì)于具有EGFR突變及ALK陽(yáng)性的NSCLC患者，EGFR、ALK-TKIs可延長(zhǎng)其無(wú)進(jìn)展生存期并提高以鉑類為基礎(chǔ)有研究證實(shí)，對(duì)于具有EGFR突變的晚期NSCLC患者，EGFR-TKIs的治療效果優(yōu)于傳統(tǒng)化療方案[38]。EGFR-TKIs已經(jīng)取得了巨大的成功，并成為NSCLC標(biāo)準(zhǔn)治療方案之一[39]。NSCLC腫瘤細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs的反應(yīng)與循環(huán)miRNA密切相關(guān)，約有20-44%患者對(duì)EGFR-TKIs產(chǎn)生獲得性耐藥，其機(jī)制為腫瘤細(xì)胞EMT(上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化)表型變化引起表觀遺傳調(diào)控的改變[40，41]。miR-134，miR-487b和miR-23a與吉非替尼耐藥有關(guān)，其機(jī)制為T(mén)GF-β1以miR-134和miR-487b為中介，通過(guò)磷酸化PTEN抑制MAGI2進(jìn)而誘導(dǎo)EMT形成[42]，同時(shí)，TGF-β1可通過(guò)激活smad，miR-23a產(chǎn)生E-鈣粘蛋白抑制來(lái)誘導(dǎo)EMT[43]。沈等[44]研究128例NSCLC(EGFR基因突變者60例，非EGFR基因突變者68例)發(fā)現(xiàn)，EGFR基因突變患者血清miR-21、miR-10b表達(dá)水平明顯增高。單變量和多變量分析顯示，抑制miR-21表達(dá)可提高吉非替尼治療NSCLC患者的總體生存率。因此，miR-21表達(dá)水平可作為獨(dú)立性預(yù)測(cè)因子用于評(píng)估EGFR-TKI治療效果。王等[45]通過(guò)實(shí)驗(yàn)隊(duì)列發(fā)現(xiàn)，在治療敏感與治療耐藥患者之間，有153種miRNAs存在差異性表達(dá)，之后的驗(yàn)證隊(duì)列發(fā)現(xiàn)，miR-21、miR-27a和miR-218在治療耐藥患者中表達(dá)明顯增加，這提示miR-21與EGFR-TKIs原發(fā)性耐藥有關(guān)。李等[46]研究顯示miR-21參與EGFR-TKIs獲得性耐藥，在25例接受EGFR-TKI治療的晚期NSCLC患者中，血清miR-21表達(dá)水平在獲得性耐藥時(shí)顯著高于基線水平(P<0.01)，經(jīng)過(guò)動(dòng)物模型驗(yàn)證，miR-21可通過(guò)下調(diào)PTEN、PDCD4及激活PI3k/Akt通路來(lái)引發(fā)EGFR-TKI耐藥形成。PTEN為腫瘤抑制蛋白，可通過(guò)將磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3)轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇4,5-二膦酸(PIP2)負(fù)調(diào)控PI3K/Akt通路[47]。PTEN基因的丟失或突變存在于許多人類惡性腫瘤疾病中，其發(fā)生與Akt激活(PI3k/Akt通路)有關(guān)，而Akt激活已被證實(shí)在化療耐藥過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

4 總結(jié)

現(xiàn)代社會(huì)生活節(jié)奏加快，多數(shù)人面對(duì)與日俱增的生活壓力傾向選擇吸煙緩解，吸煙總?cè)藬?shù)升高，肺癌的發(fā)病率升高，而肺癌診治方法提高有限，肺癌患者生存率較低，多數(shù)患者明確診斷時(shí)已處于疾病中晚期階段，部分患者出現(xiàn)全身轉(zhuǎn)移情況，限制了臨床治療效果，束縛的臨床治療手段，并增加了肺癌死亡率，因此肺癌診斷、治療方法新突破是當(dāng)前科研工作面臨的重要任務(wù)。通過(guò)檢測(cè)肺癌患者的組織、體液發(fā)現(xiàn)，miRNA均有表達(dá)，且可穩(wěn)定的存在于外周循環(huán)血漿中，這個(gè)特點(diǎn)為miRNA成為肺癌早期無(wú)創(chuàng)性診斷工具提供了可能性，為科研工作提供了新的突破口。近10年，隨著miRNA在肺癌診斷、治療及預(yù)后方面研究的逐漸深入，miRNA檢測(cè)方法及鑒定技術(shù)取得了巨大進(jìn)步，miRNA作為生物標(biāo)志物甚至治療藥物被應(yīng)用于臨床實(shí)踐方面具有大好前景。