黃然然， 辛 毅， 林 箏， 李 娜

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院, 北京市心肺血管疾病研究所， 北京 100029)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy)是糖尿病(diabete mellitus,DM)患者死亡的重要原因，最早于1972 年由 Rubler 等[1]提出。它是一種獨立的特異性心肌病，主要包括心肌病變和心臟間質(zhì)纖維化兩個方面, 最終導(dǎo)致心臟功能受損。心肌纖維化(cardiac fibrosis)指的是心肌組織成纖維細胞過度增生從而導(dǎo)致細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)大量沉積而形成的病理演變[2]，心肌纖維化在糖尿病心肌病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。在過去幾十年的研究中，研究重點主要在心肌細胞水平，對心肌纖維化的病理生理過程及發(fā)病機制成為近年來攻克糖尿病心肌病的一個新的靶點。間充質(zhì)干細胞不僅具有自我復(fù)制能力而且具有多向分化的潛能，目前研究結(jié)果顯示，間充質(zhì)干細胞可通過旁分泌和自分泌作用減輕心臟功能受損[3-5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical mesenchymal stem cells,HUMSCs)源外泌小體(exosome)對缺氧復(fù)氧損傷的心肌細胞和高糖誘導(dǎo)損傷的臍靜脈內(nèi)皮細胞具有保護作用[6]。然而外泌小體對糖尿病心肌纖維化的作用并不清楚。本研究通過尾靜脈注射外泌小體，觀察其對糖尿病小鼠心肌纖維化的影響，為糖尿病心肌纖維化的治療提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實驗動物和材料

6～8周齡SPF級C57BL/6雄性小鼠購于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院實驗動物中心，許可證號為SCXK(京)2016-0002。臍帶標本取自無妊娠期并發(fā)癥的剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦，產(chǎn)婦及家屬對臍帶用于實驗研究均知情同意并簽署知情同意書，并經(jīng)北京安貞醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。

2 主要試劑和儀器

高脂飼料購于北京華阜康生物科技股份有限公司；鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)購于Sigma。血糖儀和血糖試紙為北京怡成生物電子技術(shù)有限公司系列產(chǎn)品； 游離脂肪酸檢測試劑盒和葡萄糖測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所。酶標儀為BioTek產(chǎn)品；Vevo 770型超高頻小動物彩色多普勒超聲診斷儀為Visual Sonics產(chǎn)品；正置顯微鏡為Nikon產(chǎn)品。

3 主要方法

3.1人臍帶間充質(zhì)干細胞的提取、培養(yǎng)和鑒定以及外泌小體的提取和鑒定 將符合入選條件的臍帶于培養(yǎng)皿中用磷酸鹽緩沖液沖洗3遍，剖開臍帶，分離臍帶血管得到臍帶周圍的血管華通膠組織，將其剪成組織碎塊，加入2 g/L的Ⅱ型膠原酶消化液20 mL，當組織塊消化至半透明狀態(tài)時用移液管進行吹打，加入完全培養(yǎng)基終止消化，重復(fù)消化3次，細胞懸液均過200目銅網(wǎng),室溫1 000 r/min離心5 min,棄上清，細胞沉淀重懸于25T培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。將第3代人臍帶間充質(zhì)干細胞用流式細胞儀進行鑒定。利用外泌小體提取試劑盒提取后，固定、脫水，并于掃描電鏡觀察其形態(tài)，Western blot法檢測外泌小體蛋白水平CD63的表達水平，收集細胞培養(yǎng)上清作為陰性對照[6]。

3.2誘導(dǎo)小鼠糖尿病模型 SPF級6～8周齡的雄性C57BL/6小鼠，飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院實驗動物中心獨立換氣動物飼養(yǎng)系統(tǒng)，自由飲水，12 h光照12 h黑暗，25 ℃、空氣濕度35%適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。隨機將小鼠分為3組，對照(control,n=10)組、糖尿病(DM，n=15)組和糖尿病+外泌小體(DM+exosome，n=15)組。Control組小鼠普通飼料喂養(yǎng)。DM組與DM+exosome組小鼠高脂飲食連續(xù)5周后，小劑量STZ(45 mg/kg)每周腹腔注射1次，連續(xù)注射5周；剪鼠尾采用虹吸式血糖試紙，血糖儀實時監(jiān)測小鼠血糖水平變化，隔1天測1次，連續(xù)2周，監(jiān)測小鼠空腹血糖，3次不同時間血糖值≥16.7 mmol/L為2型糖尿病小鼠模型誘導(dǎo)成功。對照組相同頻率注射等量生理鹽水。

3.3外泌小體預(yù)處理 糖尿病模型造模成功后開始經(jīng)尾靜脈注射外泌小體，將5×106細胞在10 mL無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后，收集培養(yǎng)基，按照1 mL培養(yǎng)基+0.5 mL 外泌小體提取液的比例混合，提取外泌小體，將其溶于100 μL的生理鹽水中，作為1只小鼠1次注射用。注射前將control組、DM組和DM+exosome組3 組小鼠用0.1%的戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，用75%乙醇消毒鼠尾并在加熱板上預(yù)熱，預(yù)熱溫度37 ℃左右，使其血管舒張，分別給予control組及DM組經(jīng)尾靜脈注射0.1 mL的生理鹽水，DM+exosome組注射0.1 mL的外泌體生理鹽水混合液，每周1次，連續(xù)注射4周。

3.4彩色超聲心動圖的檢測 4周后，同時將3組小鼠心胸前區(qū)和腹前區(qū)脫毛備皮，1.2%三溴乙醇(240 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，將鼠四肢固定并連接電極，用高分辨超聲儀固定探頭行彩色超聲心動圖檢測小鼠心臟功能。每只小鼠選定連續(xù)5個心動周期，軟件自動分析并統(tǒng)計左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic dimension，LVIDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic dimension，LVIDs)、左心室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness，LVPW)、射血分數(shù)(ejection fraction，EF)及室壁縮短率(fractional shortening， FS)等檢測指標變化。

3.5生化法檢測血糖含量 小鼠經(jīng)外泌小體處理后繼續(xù)觀察1周，每天檢測1次血糖，此后將3組小鼠腹主動脈取血，用0.1%的戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，將麻醉后小鼠置于解剖板上，充分伸展四肢并固定，乙醇消毒皮膚，沿腹中線剪開皮膚及腹膜，充分暴露腹腔，輕輕推移腸管并清理脂肪組織，分離腹主動脈和腹主靜脈，用1 mL注射器取腹主動脈血于EDTA抗凝的采血管中，3 000 r/min離心15 min，取上清存于1.5 mL離心管中，用于檢測血糖和游離脂肪酸水平。

配制試劑工作液，取工作液1 000 μL和蒸餾水10 μL配制空白管；取工作液1 000 μL和校準品10 μL配制校準管；取工作液1 000 μL和樣本10 μL配制樣本管；充分混勻，37 ℃水浴15 min。顯色后在波長505 nm處，以空白調(diào)零，讀取校準管和樣本管的吸光度(A)，將吸光度值帶入說明書公式：葡萄糖濃度(mmol/L)=樣本管吸光度/校準管吸光度×校準液濃度，計算出各個樣本的葡萄糖濃度。

3.6生化法檢測游離脂肪酸的含量 取雙蒸水4 μL和試劑 I 20 μL配制空白管；取標準品4 μL、試劑 I 20 μL配制校準管；取樣品4 μL、試劑 I 20 μL配制樣本管；混勻，37 ℃孵育5 min，讀取吸光度A1，各個管中分別加入試劑 II 50 μL，混勻37 ℃孵育5 min，讀取吸光度A2，將吸光度代入說明書公式：游離脂肪酸濃度(mmol/L)=(ΔA樣本-ΔA空白)/(ΔA校準品-ΔA空白)×校準品濃度，計算出樣本中游離脂肪酸的濃度。

3.7心臟組織病理學(xué)檢測 HE染色，經(jīng)腹主動脈取血完畢后，取小鼠心臟組織固定于4%的多聚甲醛24 h，脫水，石蠟包埋，切片厚度4 μm，染色。HE染色：將切好的片子脫蠟，蘇木素染色8 min，伊紅染色3 min，自來水沖洗，脫水透明，中性樹膠封片觀察、采集圖像。Masson染色,先將樣本切片脫蠟水化，后加入麗春紅酸性復(fù)染液染色40 min，蒸餾水水洗2遍，磷鉬酸溶液1 min，冰醋酸溶液30 s，亮綠溶液10 s，蒸餾水洗兩遍，入冰醋酸溶液30 s，最后脫水透明，中性樹膠封片后觀察。并經(jīng)NIS-Elements BR軟件進行圖像采集，NIH圖形軟件計算膠原染色面積在心臟切片面積的百分比。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 人臍帶間充質(zhì)干細胞流式細胞學(xué)鑒定結(jié)果

用于動物模型的第3代人臍帶間充質(zhì)干細胞進行流式學(xué)鑒定，標記CD105-PE、CD73-FITC和CD90-FITC表達量分別為(99.50±1.68)%、(99.00±1.25)%和(99.40±1.04)%,為陽性表達，CD45-PE、CD79a-PE、HLA-DR-Cy5.5、CD34-APC、CD11b-APC和CD19-APC表達量分別為(1.8±0.31)%、(1.00±0.20)%、(0.40±0.08)%、(2.10±0.51)%、(1.90±0.21)%和(1.10±0.48)%,為陰性表達，符合間充質(zhì)干細胞特異性表型,見圖1。

2 超聲心動檢測結(jié)果

與control組比較，DM組出現(xiàn)左心室擴張，表現(xiàn)為LVIDd和LVIDs顯著擴大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(分別P<0.05和P<0.01)；同時，DM組出現(xiàn)左心室收縮功能減低，表現(xiàn)為FS和EF較control組顯著降低(P<0.01)。然而，與DM組比較，DM+exosome組左心室擴張程度減輕，LVIDs減小，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；同時左心室收縮功能明顯改善，F(xiàn)S和EF值顯著升高(P<0.01)，見圖2、表1。

3 血糖檢測結(jié)果

與control組比較，DM組血糖明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與DM組比較，DM+exosome組血糖顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

Figure 1. Phenotype of human umbilical mesenchymal stem cells.

圖1人臍帶間充質(zhì)干細胞的鑒定

Figure 2. The representative images of echocardiogram changes in different groups. A: control group; B: DM group; C: DM+exosome group.

圖2不同組別小鼠超聲心動圖比較

表1不同組別小鼠超聲心動圖結(jié)果分析

Table 1. Heart function analysis by echocardiography in different groups (Mean±SD.n=5)

IndexControlDMDM+exosomeLVIDd(mm)3.373±0.196 3.800±0.121*3.591±0.208LVIDs(mm)2.135±0.1192.992±0.191**2.471±0.150##LVPW(mm)1.334±0.1570.810±0.089**1.008±0.125##EF(%)67.616±2.97043.900±4.698**59.866±3.236##FS(%)36.672±2.37921.319±2.615**31.183±2.267##

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsDM group.

4 游離脂肪酸檢測結(jié)果

Control組血漿游離脂肪酸水平為(0.46±0.10)mmol/L，DM組的游離脂肪酸水平為(1.25±0.32)mmol/L，較control組顯著增高，兩組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01); DM+exosome組血漿游離脂肪酸水平為(0.48±0.19)mmol/L,較DM組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。

5 病理染色觀察結(jié)果

5.1HE染色 HE染色可見，control組心肌細胞排列整齊;DM組心肌細胞排列紊亂，有心肌細胞的斷裂、溶解;DM+exosome組上述心肌損傷程度減輕，見圖5。

Figure 3. The level of blood glucose in different groups. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsDM group.

圖3不同組別小鼠血糖水平的比較

Figure 4. The level of non-esterified fatty acids in blood of different groups. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsDM group.

圖4不同組別小鼠游離脂肪酸水平的比較

Figure 5. The representative images of myocardial tissue sections with HE staining (×200). A: control group; B: DM group; C: DM+exosome group.

圖5HE染色觀察不同組別小鼠心臟組織的形態(tài)變化

5.2Masson染色 Masson染色結(jié)果顯示，DM組心肌纖維化程度較control組嚴重，DM+exosome組纖維化程度較DM組減輕。用NIH圖形軟件進行膠原面積統(tǒng)計分析結(jié)果顯示：DM組纖維化面積為(19.0±4.0)%、control組為(7.4±2.5)%、DM+exosome組為(10.1±1.4)%，DM組高于control組(P<0.01)，DM+exosome組與DM組比較面積下降(P<0.01)，見圖6、7。

Figure 6. The representative images of myocardial tissue sections with Masson staining (×200). A: control group; B: DM group; C: DM+exosome group.

圖6Masson染色觀察不同組別小鼠心肌纖維化程度

Figure 7. The collagen volume fraction in different groups. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsDM group.

圖7不同組別小鼠心肌纖維化面積比較

討 論

目前，糖尿病心肌病的發(fā)病機制尚未闡明，藥物治療很難逆轉(zhuǎn)心肌損傷和心肌間質(zhì)的重塑。研究表明，在2型糖尿病大鼠的動物模型中，經(jīng)尾靜脈注射間充質(zhì)干細胞不僅能改善糖尿病大鼠的血糖水平，如果在糖尿病的早期注射，還能改善胰島β細胞功能，提高胰島素的敏感性，減輕外周組織胰島素抵抗[7]。移植的間充質(zhì)干細胞在糖尿病心肌病動物模型中能增加金屬蛋白酶2的活性，降低金屬蛋白酶9的活性，從而減弱心臟的重塑[8]。過去認為間充質(zhì)干細胞通過分化為心肌細胞和血管內(nèi)皮細胞改善心功能，但是近來研究表明，間充質(zhì)干細胞在心臟損傷修復(fù)過程中主要是通過旁分泌或者自分泌一些物質(zhì)發(fā)揮作用[9]，尤其是間充質(zhì)干細胞來源的外泌小體在間充干細胞治療中發(fā)揮的作用備受關(guān)注[10]。外泌小體是一種直徑在40～100 nm的囊泡結(jié)構(gòu)，內(nèi)含豐富的蛋白質(zhì)和RNA等物質(zhì)，主要參與細胞間的信息傳遞。間充質(zhì)干細胞來源的外泌小體無論是在組織器官缺血再灌注損傷還是糖尿病所致的腎臟損傷、腎臟纖維化都發(fā)揮了很好的治療作用[11-12]。有研究者證明,2型糖尿病鼠心肌細胞來源的外泌小體通過轉(zhuǎn)移microRNA-320到血管內(nèi)皮細胞進而抑制糖尿病心肌病組織中血管的再生,正常心肌細胞來源的外泌小體可促進心臟組織血管的再生,外泌小體作為細胞間信息交流的媒介發(fā)揮著重要作用[13-15]。然而間充質(zhì)干細胞來源的外泌小體對糖尿病心肌纖維化的作用至今報道較少。

本課題組前期實驗驗證了外泌小體中富含microRNA-22和microRNA-24，在心肌缺氧復(fù)氧的條件下能夠減少心肌細胞凋亡，保護心肌細胞的作用，而其抗凋亡作用與外泌體富含microRNA-22密切相關(guān)。其它研究表明，microRNA-22對缺血再灌注損傷心肌的保護作用是通過下調(diào)caveolin 3表達進而恢復(fù)eNOS的活性和NO的產(chǎn)生而發(fā)揮作用的[16]。MicroRNA-24能調(diào)節(jié)心肌梗死后心臟的纖維化[17]；外泌小體可有效抑制高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡，促進細胞增殖、遷移和血管再生作用。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，糖尿病小鼠的左心室明顯擴張，射血分數(shù)和室壁縮短率減小，心功能顯著降低，經(jīng)尾靜脈注射外泌小體處理后，左心室組織結(jié)構(gòu)有所改善，射血分數(shù)等心功能明顯改善；與對照組比較，糖尿病小鼠血糖和游離脂肪酸水平升高，經(jīng)外泌小體處理后血糖和游離脂肪酸水平顯著降低，說明外泌小體對于糖尿病小鼠有降糖及降脂的作用；糖尿病小鼠心肌細胞排列紊亂以及心肌纖維化面積增加，經(jīng)外泌小體處理后心肌細胞排列較整齊，心肌纖維化的面積減少。以上結(jié)果說明，間充質(zhì)干細胞外泌小體對糖尿病心肌纖維化有保護作用。

本研究結(jié)果顯示，外泌小體具有降低糖尿病鼠的血糖和血脂，改善其心功能以及減輕心肌纖維化程度的作用，為干細胞治療糖尿病心肌病提供更多有力證據(jù)，為糖尿病心血管并發(fā)癥的治療提供新的理論依據(jù)。為更加深入探討臍帶間充質(zhì)干細胞源外泌小體中的microRNA-22和microRNA-24在糖尿病心肌纖維化的作用機理，為其治療機制提供了新的思路。

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