徐正陽(yáng)， 任瑞平， 萬(wàn) 鵬， 袁祖國(guó)

(寧波市鄞州人民醫(yī)院放化療科， 浙江 寧波 315040)

乳腺癌是在女性群體中發(fā)病率最高的惡性腫瘤，早期容易發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，預(yù)后很差，嚴(yán)重危害女性健康[1]。在乳腺癌的治療中，手術(shù)治療是目前最有效的治療手段，然而對(duì)于中晚期不能進(jìn)行手術(shù)的病人或在術(shù)后的鞏固治療中，化療或免疫治療是不可缺少的治療手段[2]。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)屬于腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)超家族成員。研究表明， TRAIL能選擇性激活腫瘤細(xì)胞的凋亡通路而對(duì)正常細(xì)胞的無(wú)明顯影響，因此， TRAIL是一種副作用很小的非常有臨床應(yīng)用前景的腫瘤免疫治療藥物[3-4]。然而， 某些類型的腫瘤細(xì)胞(如乳腺癌細(xì)胞)對(duì)TRAIL治療的敏感性較低[5]，因此為了提高乳腺癌細(xì)胞對(duì)TRAIL治療的敏感性，采取一些輔助治療(如輔以中藥活性成分)協(xié)同TRAIL殺傷腫瘤細(xì)胞具有十分重要的意義。本研究的目的在于探討中藥活性成分歐前胡素(imperation，IMP)對(duì)TRAIL的抗乳腺癌協(xié)同效應(yīng)及分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌細(xì)胞系T-47D和MCF-7購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并通入5% CO2。細(xì)胞每2～3 d傳代1次，傳代時(shí)，用胰酶消化液懸浮細(xì)胞， 并用DMEM培養(yǎng)基洗滌2次，將細(xì)胞懸液按1∶3稀釋后傳代。

2 實(shí)驗(yàn)試劑

歐前胡素、重組人TRAIL、MTT試劑、二氫乙啶(dihydroe-thidium, DHE)、N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)和凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Sigma-Aldrich；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco；抗死亡受體5(death receptor 5，DR5)、cleaved caspase-8、cleaved caspase-3和GAPDH抗體購(gòu)于Cell Signaling；ECL試劑盒購(gòu)于Pierce；DR5-PE流式細(xì)胞抗體購(gòu)于R&D system；JC-1線粒體膜電位探針染料購(gòu)于江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司；DR5 siRNA購(gòu)于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；Lipofectamine 2000購(gòu)于Invitrogen。

3 方法

3.1DR5基因沉默 將DR5 siRNA(終濃度為50 nmol/L)用Lipofectamine 2000按試劑操作說(shuō)明書步驟進(jìn)行包裹后，加入到無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行混合。將貼壁的T-47D細(xì)胞置于該無(wú)血清培養(yǎng)基孵育6 h，之后棄去無(wú)血清培養(yǎng)基加入新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。

3.2相對(duì)細(xì)胞活力測(cè)定 將T-47D和MCF-7細(xì)胞用IMP (10 μmol/L)和不同濃度TRAIL (0～20 μmol/L)處理。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、歐前胡素組、TRAIL組、歐前胡素+TRAIL組及歐前胡素+TRAIL+DR5 siRNA組。對(duì)照組為細(xì)胞不加藥物處理48 h；歐前胡素組為細(xì)胞加入10 μmol/L歐前胡素處理48 h；TRAIL組為細(xì)胞加入2 μg/L TRAIL培養(yǎng)48 h；歐前胡素+TRAIL組為細(xì)胞用2 μg/L TRAIL聯(lián)合10 μmol/L歐前胡素處理48 h；歐前胡素+TRAIL+DR5 siRNA組為DR5 siRNA轉(zhuǎn)染的T-47D細(xì)胞用2 μg/L TRAIL聯(lián)合10 μmol/L歐前胡素處理48 h。各組細(xì)胞經(jīng)藥物處理完畢后加入20 μL 濃度為5 g/L的MTT試劑，并在37 °C恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h， 之后小心棄去細(xì)胞上清液并加入150 μL DMSO，振蕩使紫色絮狀物完全溶解，在570 nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度(A)。相對(duì)細(xì)胞活力=A藥物處理組/A對(duì)照組。

3.3Western blot實(shí)驗(yàn) 將T-47D細(xì)胞按上述進(jìn)行分組。藥物處理完畢后用蛋白提取液提取各組細(xì)胞中的總蛋白質(zhì)。將等量的總蛋白質(zhì)用12.5% SDS-PAGE進(jìn)行分離，分離完畢后通過(guò)電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用抗DR5、cleaved caspase-8、cleaved caspase-3和GAPDH抗體孵育過(guò)夜，之后再用帶辣根過(guò)氧化物酶的 II 抗孵育2 h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。蛋白灰度值分析用ImageJ軟件處理。目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平用它們的蛋白灰度值與內(nèi)參照GAPDH灰度值的比值表示。

3.4T-47D細(xì)胞表面DR5表達(dá)水平的檢測(cè) 將T-47D細(xì)胞分為對(duì)照組、歐前胡素組和歐前胡素+DR5 siRNA組處理。收集細(xì)胞并用帶PE熒光標(biāo)記的DR5抗體孵育細(xì)胞，后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3組細(xì)胞表面DR5的表達(dá)情況。

3.5線粒體膜電位的測(cè)定 將T-47D細(xì)胞按方法 3.2所述進(jìn)行分組。藥物處理完畢后按試劑操作說(shuō)明書步驟將細(xì)胞用JC-1染料進(jìn)行孵育，孵育完畢后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)JC-1發(fā)出的紅色熒光，紅色熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，線粒體膜電位越高[6]。

3.6活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)水平的檢測(cè) 將T-47D細(xì)胞用藥物處理完畢后按試劑操作說(shuō)明書步驟將細(xì)胞用DHE染料進(jìn)行孵育，孵育完畢后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DHE發(fā)出的紅色熒光，紅色熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，ROS水平越高[7]。

3.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將各組細(xì)胞經(jīng)藥物處理完畢后按照凋亡試劑盒說(shuō)明書步驟將碘化丙啶和Annexin V加入細(xì)胞中孵育20 min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡，Annexin V陽(yáng)性細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。2組間均數(shù)的比較采用 Student’st檢驗(yàn)，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)后行Bonferroni校正的t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 歐前胡素對(duì)TRAIL存在協(xié)同抗乳腺癌效應(yīng)

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雖然歐前胡素(10 μmol/L)單獨(dú)處理對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用輕微，但其能顯著提高各濃度TRAIL對(duì)T-47D細(xì)胞和MCF-7的殺傷活性(P<0.05)。表明歐前胡素對(duì)TRAIL存在協(xié)同抗乳腺癌效應(yīng)，能顯著增強(qiáng)TRAIL對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷活性和凋亡誘導(dǎo)活性，見圖1。

Figure 1. Imperatorin enhanced the cytotoxicity of TRAIL to breast cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1歐前胡素增強(qiáng)TRAIL對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷活性

2 歐前胡素通過(guò)ROS途徑上調(diào)乳腺癌細(xì)胞表面DR5的數(shù)量

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 歐前胡素能顯著提高T-47D細(xì)胞 TRAIL特異性受體DR5的蛋白表達(dá)水平，見圖2A； 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 歐前胡素處理能明顯上調(diào)T-47D細(xì)胞表面DR5的數(shù)量，然而轉(zhuǎn)染DR5 siRNA沉默DR5基因表達(dá)后，歐前胡素處理不能再增加T-47D細(xì)胞表面DR5的數(shù)量，見圖2B。另外，歐前胡素處理能明顯誘導(dǎo)T-47D細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，見圖2C；用ROS清除劑NAC[7]對(duì)T-47D細(xì)胞進(jìn)行處理后，歐前胡素對(duì)DR5的上調(diào)作用受到明顯抑制，見圖2D，提示歐前胡素能通過(guò)誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生增加T-47D細(xì)胞表面DR5的數(shù)量。這可能是歐前胡素發(fā)揮對(duì)TRAIL協(xié)同作用的機(jī)制。

3 歐前胡素通過(guò)上調(diào)T-47D細(xì)胞 DR5的表達(dá)促進(jìn)TRAIL誘導(dǎo)的線粒體途徑凋亡

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在T-47D細(xì)胞中轉(zhuǎn)染DR5 siRNA后，TRAIL聯(lián)合歐前胡素對(duì)T-47D細(xì)胞的殺傷活性受到明顯抑制，見圖3A； 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 歐前胡素聯(lián)合處理能顯著提高TRAIL對(duì)T-47D細(xì)胞線粒體膜電位的損傷，而轉(zhuǎn)染DR5 siRNA能顯著抑制兩者聯(lián)合對(duì)T-47D細(xì)胞線粒體膜電位的損傷，見圖3B； Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 歐前胡素聯(lián)合處理能顯著提高TRAIL對(duì)T-47D細(xì)胞caspase-8和caspase-3的活化，而轉(zhuǎn)染DR5 siRNA能顯著抑制兩者聯(lián)合對(duì)T-47D細(xì)胞caspase-8和caspase-3的活化，見圖3C； 同時(shí)，歐前胡素聯(lián)合處理能顯著提高TRAIL對(duì)T-47D細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)，而轉(zhuǎn)染DR5 siRNA能顯著抑制兩者聯(lián)合誘導(dǎo)的T-47D細(xì)胞凋亡的發(fā)生，見圖3D。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明歐前胡素通過(guò)上調(diào)T-47D細(xì)胞中DR5的表達(dá)促進(jìn)TRAIL誘導(dǎo)的線粒體途徑凋亡。

討 論

歐前胡素是從白芷根中提取的香豆素類天然活性物質(zhì)。研究表明， 歐前胡素對(duì)一些腫瘤細(xì)胞有一定的抑制作用，如歐前胡素能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞中低氧誘導(dǎo)因子1α 的表達(dá)，從而抑制結(jié)腸癌的增殖和血管生成；又如歐前胡素能通過(guò)抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中一些熱休克蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)其發(fā)生程序性死亡。另外，歐前胡素還被報(bào)道能作為一種增敏劑，在宮頸癌的輔助治療中，歐前胡素能下調(diào)腫瘤細(xì)胞中Mcl-1 的表達(dá)，提高其對(duì)凋亡信號(hào)的敏感性，從而增強(qiáng)化療藥物的抗腫瘤活性[8-10]。然而，歐前胡素對(duì)免疫治療是否有協(xié)同增效作用，至今仍報(bào)道較少。在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)歐前胡素能顯著增強(qiáng)TRAIL對(duì)乳腺癌細(xì)胞系T-47D和MCF-7的殺傷活性，表明歐前胡素與TRAIL存在協(xié)同效應(yīng)，能提高TRAIL的抗乳腺癌活性。

Figure 2. Imperatorin (IMP) upregulated the level of DR5 on the surface of T-47D cells through the ROS pathway. A: IMP upregulated the expression of DR5 in T-47D cells; B: treatment with IMP increased the levels of DR5 on the surface of T-47D cells; C: IMP increased the production of ROS in T-47D cells; D: NAC abolished the effect of IMP on increasing the DR5 expression level in T-47D cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsIMP group;△P<0.05vsTRAIL group;&P<0.05vsIMP+TRAIL group.

圖2歐前胡素通過(guò)ROS途徑上調(diào)T-47D細(xì)胞表面DR5的表達(dá)水平

在TRAIL依賴的凋亡信號(hào)通路中，TRAIL首先與細(xì)胞表面的DR4或DR5結(jié)合形成死亡受體復(fù)合物，該復(fù)合物能募集細(xì)胞中的caspase-8并使之發(fā)生活化；活化的caspase-8通過(guò)BID途徑使腫瘤細(xì)胞的線粒體發(fā)生失能，導(dǎo)致線粒體膜電位下降從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生線粒體途徑的凋亡[11-13]。DR5的表達(dá)受細(xì)胞中多種刺激因子的調(diào)控，腫瘤細(xì)胞中ROS的聚集能誘導(dǎo)細(xì)胞DR5的顯著表達(dá)[14-15]。在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)歐前胡素能顯著誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生并上調(diào)TRAIL的特異性受體DR5的表達(dá)水平，提示歐前胡素能通過(guò)ROS途徑上調(diào)乳腺癌細(xì)胞表面DR5的數(shù)量，從而對(duì)TRAIL發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)。當(dāng)用siRNA下調(diào)乳腺癌細(xì)胞中DR5的表達(dá)后，歐前胡素對(duì)TRAIL的協(xié)同效應(yīng)受到明顯抑制，證明歐前胡素是通過(guò)增加乳腺癌細(xì)胞中DR5的表達(dá)水平增強(qiáng)TRAIL依賴的凋亡信號(hào)，促使乳腺癌細(xì)胞發(fā)生caspase-8的活化，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生線粒體途徑的凋亡。

綜上所述，本研究證明了歐前胡素對(duì)TRAIL有協(xié)同抗乳腺癌效應(yīng)，其機(jī)制可能在于歐前胡素能上調(diào)乳腺癌細(xì)胞中DR5的表達(dá)水平。這些研究結(jié)果為更有效地將TRAIL應(yīng)用于臨床提供了新的策略和思路。

Figure 3. Imperatorin (IMP) enhanced the mitochondrial apoptosis induced by TRAIL through increasing the expression of DR5. A: transfection withDR5 siRNA inhibited the IMP-promoted cell death induced by TRAIL in T-47D cells; B: transfection withDR5 siRNA inhibited the IMP-promoted damage of mitochondrial membrane potential induced by TRAIL in T-47D cells; C: co-treatment with IMP and TRAIL significantly triggered the activation of caspase-8 and caspase-3 in T-47D cells; D: co-treatment with IMP and TRAIL significantly induced the apoptosis of T-47D cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsTRAIL group;&P<0.05vsIMP+TRAIL group.

圖3歐前胡素通過(guò)上調(diào)T-47D細(xì)胞中DR5的表達(dá)促進(jìn)TRAIL誘導(dǎo)的線粒體途徑凋亡

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