沈丹萍， 戈東輝， 陳顯達(dá)， 吳雨晴， 李 磊， 褚茂平

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院， 育英兒童醫(yī)院， 兒童心臟中心， 溫州醫(yī)科大學(xué)心臟發(fā)育與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所， 浙江 溫州 325027)

堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是成纖維生長因子家族的一員，在神經(jīng)系統(tǒng)和心臟中表達(dá)豐富，并且具有促進(jìn)血管生成和細(xì)胞增殖遷移等作用[1]。研究表明，外源性bFGF能夠減輕腦損傷患者腦水腫，保護(hù)血腦屏障的完整性；同樣，在脊髓損傷患者中，它能夠保證血-脊髓屏障的完整性[2-3]。在心肌缺血再灌注模型中，bFGF能夠通過激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(protein kinase B，PKB，即AKT)信號通路抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和過度的自噬反應(yīng)， 以及清除過多的泛素化蛋白從而來減輕心臟的損傷[4-5]。bFGF也能促進(jìn)急性心梗時(shí)Bcl-2的表達(dá)，抑制Bax的表達(dá)，減少心肌凋亡[6]。另有研究表明， bFGF能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂和血管新生。Nakamichi等[7]研究發(fā)現(xiàn)了bFGF能夠促進(jìn)小鼠的皮膚損傷處血管新生。雖然已有幾項(xiàng)研究表明bFGF能夠促進(jìn)急性心肌缺血區(qū)血管新生，改善左心室功能[8]，但其對于慢性心肌梗死的作用及其深入機(jī)制尚未見報(bào)道。本研究通過復(fù)制小鼠心肌梗死模型，觀察bFGF能否通過AKT通路激活下游的缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)以及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白，從而促進(jìn)心臟梗死區(qū)微血管新生，改善心肌重構(gòu)和心功能。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

清潔級C57/B6小鼠，雄性，8～12周齡，18～20 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，使用許可證號為SYXK(浙)2015-0009。

2 主要試劑

bFGF購自浙江生物技術(shù)和制藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；Masson染色試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒和Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)購自上海碧云天公司；抗p-AKT、 AKT和HIF-1α抗體及HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG購自CST；抗VEGF抗體購自Santa Cruz；抗CD31抗體購自Abcom；ECL 顯色液購自Advansta；異氟烷購自瑞沃德公司；冠狀動(dòng)脈結(jié)扎線購自寧波成和公司；其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

3 主要方法

3.1小鼠心肌梗死模型的建立 用異氟烷吸入麻醉小鼠，直視下氣管切開，小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸，左側(cè)第4 肋間入胸，識別前降支走行范圍，7/0滑線結(jié)扎前降支，當(dāng)左心室前壁部分顏色轉(zhuǎn)為蒼白，確認(rèn)小鼠心梗模型成功之后一直維持血管結(jié)扎，結(jié)扎位置基本相同； 假手術(shù)(sham)組用7/0滑線穿過前降支下面而不結(jié)扎； bFGF治療組于造模成功7 d后隔天腹腔注射給藥，每只5 μg，直至28 d，總共給藥10次。

3.2超聲心動(dòng)圖檢測 心梗后7 d及28 d時(shí)，用4%水合氯醛腹腔注射麻醉動(dòng)物，取仰臥位。使用西門子ACUSON SEQUOIA 512彩色超聲診斷儀檢查小鼠心功能，探頭頻率為12～14 Mz。取左心室乳頭肌水平二維左室短軸切面，記錄左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter,LVESD)及左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDD)，由超聲心動(dòng)圖電腦自動(dòng)計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)和左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)，取連續(xù)3個(gè)心動(dòng)周期的平均值。

3.3心肌組織Masson染色 實(shí)驗(yàn)小鼠28 d后脫頸椎處死， 立即開胸取心臟，放入PBS中(冰上預(yù)冷)，將血液擠干凈，將心室組織做石蠟切片，之后常規(guī)脫蠟入水，蒸餾水沖洗干凈滴入麗春紅液染4 min；再次蒸餾水流水沖洗干凈，滴入磷鉬酸液染2 min；甩干液體后用苯胺藍(lán)液染7 min。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

3.4免疫熒光染色觀察 將上述各組小鼠心臟組織OCT包埋后做冰凍切片，室溫復(fù)溫30 min后PBS清洗3次，擦干之后加5% BSA室溫封閉30 min。然后用抗CD31抗體(1∶200)4 °C孵育過夜。用PBS-Tween洗3遍后，用Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶500)在37 ℃孵育1 h，PBS-Tween洗4次后，DAPI染色7 min，PBS-Tween洗4次后擦干加抗熒光淬滅劑后封片。熒光顯微鏡下拍照。

3.5Western blot 實(shí)驗(yàn) 小鼠脫頸椎處死后立即開胸取心臟，放入PBS中(冰上預(yù)冷)，將血液擠干凈，保留冠脈結(jié)扎線以下左室心肌組織， 稱量后放入有裂解液(含蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑)的勻漿管中，勻漿機(jī)裂解心肌組織，冰上裂解30 min，離心后超聲3次，每次間隔1 min，12 000×g、4 ℃離心30 min后取上清行BCA法蛋白定量，準(zhǔn)備蛋白樣品。用10% SDS-PAGE 分離蛋白后，轉(zhuǎn)膜，用5%的脫脂牛奶封閉2 h，加 I 抗4 ℃孵育過夜，TBS-Tween 洗3 次，加HRP 偶聯(lián) II 抗于室溫孵育2 h，TBS-Tween 洗3 次，加ECL 液曝光、顯影、定影。用掃描儀掃描曝光膠片，用Image Lab軟件分析條帶灰度值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 bFGF改善心肌梗死后心肌纖維化程度

根據(jù)Masson染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 28 d后心肌梗死組心肌組織出現(xiàn)明顯的心肌纖維化，而bFGF給藥組能夠有效減少心肌纖維化程度(P<0.05)，見圖1。

2 bFGF改善心肌梗死后的心功能

超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示，心肌梗死組各項(xiàng)心功能比正常假手術(shù)組較差，bFGF組能顯著改善心肌梗死28 d后小鼠心功能，與MI組相比， bFGF組能有效減少左室收縮期末內(nèi)徑(P<0.05)，LVEF和LVFS值明顯升高(P<0.05)，見圖2。

Figure 1. Myocardial tissues with Masson staining at 28 d after MI (×400). Mean±SD.n=3.#P<0.05vssham group;&P<0.05vsMI group.

圖1心肌梗死28d后心肌組織的Masson染色結(jié)果

Figure 2. The results of echocardiography at 28 d after MI. Mean±SD.n=10.#P<0.05vssham group;&P<0.05vsMI group.

圖2心肌梗死28d后的超聲心動(dòng)圖結(jié)果

3 bFGF促進(jìn)梗死區(qū)組織血管新生

CD31是內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)對梗死區(qū)組織中的CD31進(jìn)行免疫熒光染色來檢測梗死區(qū)微毛細(xì)血管的數(shù)量。在高倍鏡下，梗死區(qū)域可見MI組的血管密度比sham組的低，而bFGF給藥組的血管密度比MI組高(P<0.05)，見圖3。

4 bFGF激活心肌AKT/HIF-1α/VEGF信號通路

已有研究報(bào)道在血管內(nèi)皮缺氧的情況下，能夠上調(diào)PI3K/AKT/HIF-1α信號通路的活性，從而能夠改善血管內(nèi)皮細(xì)胞抗缺氧損傷的作用[9]。因此我們推測bFGF也能夠通過該通路促進(jìn)梗死區(qū)血管新生，我們檢測了第10天時(shí)小鼠心肌中AKT、HIF-1α以及其靶蛋白VEGF的蛋白水平變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)第10天時(shí)心梗組AKT磷酸化水平比假手術(shù)組要高(P<0.05)，但是HIF-1α及VEGF蛋白水平和假手術(shù)組比較差異并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；而與心梗組比較，bFGF給藥組的HIF-1α(P<0.05)及VEGF(P<0.05)的蛋白水平更高，心梗28 d后的蛋白變化趨勢跟第10天的蛋白變化趨勢一致，說明bFGF通過隔天腹腔給藥能夠激活A(yù)KT/HIF-1α/VEGF通路，見圖4。

Figure 3. Myocardial tissues with CD31 immunofluorescence staining at 28 d after MI (×200). Mean±SD.n=3.#P<0.05vssham group;&P<0.05vsMI group.

圖3心肌梗死28d后小鼠心肌病理切片的CD31免疫熒光染色

Figure 4. The levels of AKT/HIF-1α/VEGF signaling pathway-related proteins at 10 d and 28 d after MI.Mean±SD.n=3 .#P<0.05vssham group;&P<0.05vsMI group.

圖4心肌梗死第10天及第28天后各組AKT/HIF-1α/VEGF通路相關(guān)蛋白水平的變化

討 論

隨著心肌梗死發(fā)病率和致死率的逐年攀升，已成為嚴(yán)重威脅全球人民的身體健康。急性期心肌梗死主要的死亡原因是急性心衰竭，隨著醫(yī)療水平的進(jìn)步，內(nèi)科藥物溶栓、介入支架和外科的搭橋手術(shù)使急性期心梗發(fā)展成急性心衰進(jìn)而導(dǎo)致死亡的幾率大幅度下降。但隨著病情的進(jìn)一步發(fā)展可轉(zhuǎn)為慢性期。慢性期主要以心臟纖維化重塑為主，如果纖維重塑過度會(huì)引發(fā)慢性心衰導(dǎo)致死亡。然而，到目前為止預(yù)防和治療心臟纖維化重塑過度尚無好的方法[10]。

近年來用外源性蛋白因子促進(jìn)血管新生可能成為一種有效治療心肌缺血的辦法。bFGF在心臟呈高表達(dá)，具有較強(qiáng)的促內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和分化的作用。研究表明， 心肌內(nèi)注射外源性bFGF，能有效減少梗死面積，促血管新生[11]。但該給藥途徑具有創(chuàng)傷性，因此本研究采用了腹腔隔天注射給藥，對該方法進(jìn)行了探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隔天腹腔注射給藥也能有效提高小鼠心功能，并且能夠減少心肌纖維化。

持續(xù)表達(dá)HIF-1α能夠減少心臟梗死區(qū)域，促進(jìn)心梗邊緣區(qū)新生血管形成，從而改善心肌重構(gòu)[12]。心肌缺血雖然能夠促進(jìn)HIF-1α表達(dá)增加，但是這種代償性適應(yīng)是暫時(shí)性的，HIF-1α在心梗后期表達(dá)量將趨于正常[13]。在組織缺氧環(huán)境下，作為HIF-1α的靶蛋白， VEGF能特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管形成，從而部分緩解組織缺血[14]。已有研究表明，bFGF在急性心肌梗死后，能夠增加HIF-1α和VEGF的mRNA水平[15]。本研究發(fā)現(xiàn)bFGF能夠促進(jìn)梗死邊緣區(qū)血管新生，并深入研究了血管新生的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)bFGF給藥組心肌中AKT磷酸化水平、HIF-1α及VEGF蛋白水平明顯比心梗組要高，也說明了bFGF可能通過激活該通路促進(jìn)梗死邊緣區(qū)血管新生，從而改善心肌纖維化保護(hù)心功能。

本實(shí)驗(yàn)的最大局限之處是沒有設(shè)立bFGF抑制劑組，在血管新生機(jī)制研究方面，發(fā)現(xiàn)bFGF能夠激活A(yù)KT/HIF-1α/VEGF通路，但是不能夠說明一定是通過該通路促進(jìn)梗死邊緣區(qū)的血管新生，或者該通路可能協(xié)同其它通路共同參與血管新生的作用。因此對于bFGF促進(jìn)心肌梗死邊緣區(qū)血管新生的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究采用建立小鼠心肌梗死模型，隔天腹腔注射 bFGF，發(fā)現(xiàn)bFGF給藥組比心梗組的心功能有好轉(zhuǎn)，心肌纖維化減少，梗死邊緣區(qū)新生血管增多；并且發(fā)現(xiàn)bFGF給藥組能夠提高AKT/HIF-1α/VEGF的蛋白水平，提示bFGF可能通過該通路促進(jìn)梗死邊緣區(qū)血管新生，保護(hù)心臟。

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