朱文赫， 張 巍， 李 妍， 徐俊杰， 張 紅， 呂士杰

(吉林醫(yī)藥學(xué)院生物化學(xué)教研室， 吉林 吉林 132013)

1971年中國(guó)科學(xué)家從中藥黃花蒿中提取出了青蒿素，證實(shí)青蒿素是一個(gè)具有過氧基團(tuán)的新倍半萜內(nèi)酯化合物。青蒿琥酯(artesunate，ART)是半合成的青蒿素衍生物，具有水溶性好、安全性高和耐藥性低的突出優(yōu)點(diǎn)，有很好的抗瘧效果，同時(shí)其表現(xiàn)出的強(qiáng)大抗腫瘤活性越來越引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者注意[1-2]。Zhao等[3]通過體外培養(yǎng)A549細(xì)胞，并構(gòu)建裸鼠體內(nèi)移植瘤模型發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯能增強(qiáng)A549細(xì)胞的放射敏感性，青蒿琥酯聯(lián)合放療可抑制移植瘤的生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)[4]，青蒿琥酯能夠抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，并通過抑制骨髓血管新生和逆轉(zhuǎn)骨髓瘤細(xì)胞多藥耐藥等多種機(jī)制，抑制多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生和發(fā)展。雖然青蒿琥酯對(duì)于不同組織來源的腫瘤細(xì)胞具有一定的殺傷性，但具體機(jī)制尚未完全明確。

因此，本研究以人肝癌細(xì)胞HepG2為研究對(duì)象，探討青蒿琥酯促人肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡作用及其可能的分子機(jī)制，為青蒿琥酯在肝癌臨床治療中應(yīng)用提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞、試劑與儀器

人肝癌HepG2細(xì)胞購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，由吉林醫(yī)藥學(xué)院生物化學(xué)教研室保存。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L 鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天更換培養(yǎng)液1次，待細(xì)胞長(zhǎng)滿至培養(yǎng)瓶底，以0.25%胰酶消化傳代。

青蒿琥酯購(gòu)于Sigma；抗Bax、Bcl-2、caspase-3和細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt C)抗體購(gòu)于Santa Cruz；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。Muse細(xì)胞分析儀購(gòu)于Merch Millipore；550型酶標(biāo)儀購(gòu)于Bio-Rad；CKX41-A32PH倒置顯微鏡購(gòu)于Olympus。

2 方法

2.1MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率的變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，0.25%胰酶消化并調(diào)整細(xì)胞數(shù)至5×107/L。以每孔200 μL接種于96 孔板中，常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，分別給予10、20、40、80和160 μmol/L的青蒿琥酯，每組設(shè)5復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μL MTT，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄培養(yǎng)孔內(nèi)上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩搖勻，在酶標(biāo)儀上以波長(zhǎng)490 nm 測(cè)各孔的吸光度(A)，并計(jì)算細(xì)胞存活抑制率。細(xì)胞存活抑制率(%)= (1-A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組)×100%。

2.2Hoechst 33258 熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡形態(tài) 取藥物處理后的HepG2細(xì)胞，加入0.5 mL固定液固定10 min。棄去固定液，用PBS洗2次，每次3 min，吸盡液體。加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，染色5 min。用PBS洗2遍，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)的改變。

2.3細(xì)胞分析術(shù)檢測(cè)凋亡 取藥物處理后的HepG2細(xì)胞，0.25% 胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，收集約1×105個(gè)細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，100 μL PBS重懸細(xì)胞，加入100 μL 凋亡試劑盒染料，Muse細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

2.4HepG2細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平的檢測(cè) 收集處理后1×109/L 細(xì)胞懸液，PBS 洗滌后，加入1 mL PBS液重懸，加入2.5 mmol/L的CDFH-DA 液40 μL，使終濃度為100 μmol/L，在37 ℃下避光孵育1 h，PBS洗滌后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.5Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 取藥物處理后的HepG2細(xì)胞，0.25%胰酶消化，1 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞，以PBS洗2次，用PIPA細(xì)胞裂解液于冰浴裂解，12 000 r/min離心5 min，收集上清。經(jīng)BCA法進(jìn)行蛋白定量后，取等量樣品行12%SDS-PAGE。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后，兔抗人Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9和Cyt C抗體(濃度1∶1 000)孵育過夜，再以辣根過氧化酶標(biāo)記的 II 抗封閉液孵育1 h，用ECL顯影，掃描紀(jì)錄。

2.6Western blot檢測(cè)NADPH氧化酶亞基p47phox和p22phox表達(dá)水平 取HepG2細(xì)胞，經(jīng)50 μmol/L的NADPH氧化酶抑制劑夾竹桃麻素(apocynin)預(yù)孵育30 min后, 再加入56.57 μmol/L(IC50)的青蒿琥酯處理細(xì)胞。按照方法2.5所述，提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)NADPH氧化酶亞基p47phox和p22phox的表達(dá)。

2.7Apocynin對(duì)青蒿琥酯誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS的影響 取HepG2細(xì)胞，經(jīng)50 μmol/L的apocynin預(yù)孵育30 min后，再加入56.57 μmol/L(IC50)的青蒿琥酯處理細(xì)胞。按照方法2.4所述，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用 SPSS 13.0 軟件處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，對(duì)照組與給藥各組比較進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 青蒿琥酯對(duì)HepG2細(xì)胞活力的抑制作用

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度青蒿琥酯作用HepG2細(xì)胞后，HepG2細(xì)胞的活力受到明顯抑制，且隨青蒿琥酯藥物濃度增加，抑制作用顯著提高(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. Inhibitory effect of ART at different concentrations on the viability of HepG2 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.

圖1不同濃度青蒿琥酯對(duì)HepG2細(xì)胞活力的抑制作用

2 青蒿琥酯對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響

Hoechst 33258 核染色結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，青蒿琥酯給藥組的細(xì)胞凋亡明顯增多，細(xì)胞染色質(zhì)固縮，細(xì)胞核呈致密濃染色，且胞核變小濃集，呈現(xiàn)凋亡細(xì)胞的特征，見圖2。

Figure 2. The effects of ART on the morphological changes of apoptotic HepG2 cells(×200). A: control group; B, C and D: the cells were treated with ART at 20, 40 and 80 μmol/L, respectively.

圖2青蒿琥酯對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響

3 青蒿琥酯對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡結(jié)果顯示，青蒿琥酯作用HepG2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡比例明顯增加。對(duì)照組HepG2細(xì)胞早期凋亡率為2.35%±0.70%，與對(duì)照相比，青蒿琥酯給藥組隨著青蒿琥酯給藥濃度的升高，HepG2細(xì)胞凋亡率明顯升高，早期凋亡率分別為12.38%±0.80%、18.86%±1.72%和29.59%±1.49%，見圖3。

Figure 3. The cell apoptosis was detected by flow cytometry. A: control group; B, C and D: the cells were treated with ART at 20, 40 and 80 μmol/L, respectively. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.

圖3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

4 青蒿琥酯對(duì)HepG2細(xì)胞ROS水平的影響

活性氧測(cè)定結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS的水平隨著青蒿琥酯給藥濃度的升高呈現(xiàn)升高趨勢(shì)(P<0.05)，見圖4。

5 青蒿琥酯對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，不同濃度青蒿琥酯給藥組HepG2細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)比例升高。為了進(jìn)一步探討青蒿琥酯誘發(fā)HepG2細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，我們又檢測(cè)了cleaved caspase-3和CytC蛋白水平的變化，結(jié)果顯示其蛋白水平均明顯上調(diào)。上述結(jié)果表明青蒿琥酯促HepG2細(xì)胞凋亡機(jī)制可能與線粒體凋亡途徑相關(guān)，見圖5。

Figure 4. The changes of intracellular ROS in the HepG2 cells after treatment with ART for 24 h. A: control group; B, C and D: the cells were treated with ART at 20, 40 and 80 μmol/L, respectively. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.

圖4青蒿琥酯誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞24h后細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化

6 Western blot檢測(cè)p47phox和p22phox的表達(dá)水平

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，青蒿琥酯給藥組細(xì)胞內(nèi)p47phox和p22phox蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。與青蒿琥酯給藥組相比，預(yù)先經(jīng)過NADPH氧化酶抑制劑apocynin孵育組p47phox和p22phox蛋白表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，見圖6。

7 Apocynin對(duì)青蒿琥酯誘導(dǎo)HepG2內(nèi)ROS生成的影響

活性氧測(cè)定結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，青蒿琥酯給藥組HepG2細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。與青蒿琥酯給藥組相比，預(yù)先經(jīng)過apocynin孵育組ROS呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，見圖7。

討 論

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，惡性程度高、生存期短，目前肝癌的手術(shù)和介入化療等技術(shù)雖有所提高，但療效仍然不盡人意，故尋找新的低毒高效藥物意義重大。近年來研究發(fā)現(xiàn)[5-7]，青蒿琥酯在腫瘤治療中展現(xiàn)了潛在的應(yīng)用價(jià)值，但是其具體作用機(jī)制仍然有待進(jìn)一步的研究。因此，本研究以人肝癌細(xì)胞HepG2為研究對(duì)象，探討青蒿琥酯對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用及其機(jī)制，為青蒿琥酯的進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

Figure 5. The protein levels of apoptosis-related proteins were detected by Western blot. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.

圖5Westernblot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白水平的變化

ROS是一類氧的單電子還原產(chǎn)物，包括單線態(tài)氧、超氧化物、過氧化物、氫氧自由基、次氯酸及一氧化氮等。ROS可以作為第二信使參與對(duì)各種刺激的信號(hào)傳導(dǎo)，而最新研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生不僅是細(xì)胞分裂失控所導(dǎo)致細(xì)胞過度增生所致，同時(shí)也可能是細(xì)胞凋亡通路受阻所致，凋亡的誘導(dǎo)和抑制與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)[8-9]。活性氧是細(xì)胞凋亡的早期信號(hào)，它可作用于線粒體，促使線粒體膜通透性改變、線粒體膜電位下降、細(xì)胞色素C釋放。它還能與Apaf-1、caspase-9前體、ATP/dATP形成凋亡體，然后召集并激活caspase-9和caspase-3，進(jìn)而引發(fā)caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使DNA 斷裂，引起細(xì)胞凋亡[10-12]。

Figure 6. The effects of ART and apocynin on the expression of p47phoxand p22phox. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsART group.

圖6青蒿琥酯和apocynin對(duì)p47phox和p22phox表達(dá)的影響

Figure 7. The effect of apocynin on ROS production induced by ART in the HepG cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsART group.

圖7Apocynin對(duì)青蒿琥酯誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS生成的影響

本實(shí)驗(yàn)首先通過MTT實(shí)驗(yàn)觀察青蒿琥酯對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響。結(jié)果顯示青蒿琥酯能抑制HepG2細(xì)胞的活力，其抑制作用隨著青蒿琥酯藥物濃度的升高呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡結(jié)果顯示，青蒿琥酯作用于HepG2細(xì)胞24 h，細(xì)胞凋亡比例增加，我們可以判斷青蒿琥酯是通過細(xì)胞凋亡方式來抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯作用后肝癌細(xì)胞HepG2內(nèi)的ROS明顯增加，且在一定的濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴。為了進(jìn)一步明確青蒿琥酯誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，我們通過Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)變化，結(jié)果顯示，青蒿琥酯作用HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)比例升高，cleaved caspase-3和Cyt C蛋白表達(dá)升高。Bax與Bcl-2有很高的同源性，二者形成的蛋白二聚體是細(xì)胞死亡信號(hào)通路的分子開關(guān)，Bax相對(duì)量高于Bcl-2 時(shí)，Bax同二聚體的數(shù)量增多，促進(jìn)細(xì)胞死亡[13]；而Bcl-2表達(dá)量占優(yōu)勢(shì)時(shí)，則促進(jìn)形成Bcl-2 /Bax異二聚體，并使Bcl-2 同二聚體量增多，抑制細(xì)胞凋亡。線粒體是ROS 的主要來源和促凋亡作用靶點(diǎn)，線粒體凋亡途徑其特點(diǎn)是線粒體級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放，活化caspases-9，并形成凋亡小體及多蛋白復(fù)合物，進(jìn)而活化下游caspase-3，放大死亡信號(hào)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14-16]。因此，青蒿琥酯抑制肝癌細(xì)胞HepG2的增殖并誘發(fā)細(xì)胞凋亡可能與線粒體凋亡途徑相關(guān)。

NADPH 氧化酶是體內(nèi)氧化應(yīng)激的另一個(gè)重要來源，包括存在于胞膜的p22phox和gp91phox以及存在于胞質(zhì)中的p47phox、p67phox等亞單位[17]。為了進(jìn)一步明確青蒿琥酯促HepG2細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，我們檢測(cè)了青蒿琥酯對(duì)HepG2細(xì)胞中p22phox和p47phox蛋白表達(dá)變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯能上調(diào)HepG2細(xì)胞內(nèi)p22phox和p47phox蛋白表達(dá)，而采用NADPH氧化酶抑制劑apocynin能夠下調(diào)青蒿琥酯給藥組p22phox和p47phox蛋白表達(dá)。

綜上所述，青蒿琥酯可能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生活性氧，由活性氧引發(fā)Bcl-2下調(diào)和Bax上調(diào)，使線粒體膜電位喪失，通透性增加，釋放細(xì)胞色素C，激活典型的線粒體凋亡通路，是青蒿琥酯誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的可能分子機(jī)制之一。本研究為青蒿琥酯在肝癌中的治療應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

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