王維娜， 曹燕珍， 陳海霞， 張 煥， 房新志

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科， 烏魯木齊 830011)

甲狀腺癌是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，約85%～90%是甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid cancer，PTC)，鼠類肉瘤濾過(guò)性毒菌致癌同源體B1(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1,BRAF)作為甲狀腺乳頭狀癌診斷和預(yù)后的分子生物學(xué)標(biāo)志及開(kāi)發(fā)治療甲狀腺乳頭狀癌的靶基因，其基因突變是甲狀腺癌研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)。目前部分研究顯示BRAF V600E基因突變型甲狀腺乳頭狀癌臨床侵襲性較強(qiáng)，臨床分期更高，更易復(fù)發(fā)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[1-2]，另有部分研究認(rèn)為BRAF V600E基因突變與甲狀腺乳頭狀癌的臨床病理特征的相關(guān)性仍存爭(zhēng)議[3]。 本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR) 法檢測(cè)110例甲狀腺乳頭狀癌患者及38例甲狀腺良性病變患者BRAF V600E基因突變情況，旨在探討甲狀腺乳頭狀癌患者的臨床病理特征與基因突變之間的相關(guān)性,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象收集2016年1月-2016年8月在新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院110例甲狀腺乳頭狀癌患者的手術(shù)標(biāo)本，選取38例甲狀腺良性病變作為對(duì)照，樣本的獲得均經(jīng)過(guò)患者知情同意，標(biāo)本均經(jīng) 10%中性福爾馬林液固定、石蠟包埋、組織切片后經(jīng)常規(guī)病理診斷確診，收集臨床病理資料，所有患者術(shù)前未行內(nèi)、外科放射治療，患者除甲狀腺乳頭狀癌外未發(fā)現(xiàn)其他惡性腫瘤。110例甲狀腺乳頭狀癌患者中48例行甲狀腺全葉切除術(shù)，患側(cè)葉、狹部及部分對(duì)側(cè)葉切除術(shù)36例，26例行患側(cè)葉及狹部切除；100例患者行中央?yún)^(qū)或側(cè)頸淋巴結(jié)清掃，4例患者未清掃淋巴結(jié)，另有6例清掃的中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)為脂肪組織，未見(jiàn)淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)及腫瘤； 96例患者行優(yōu)甲樂(lè)治療，14例行左旋甲狀腺素片治療，11例行131I全身顯像及碘放射治療。38例甲狀腺良性病變包括結(jié)節(jié)性甲狀腺腫13例，淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎15例，濾泡性腺瘤10例；女性31例，男性7例；年齡28～52歲，中位年齡40.5歲。甲狀腺乳頭狀癌及甲狀腺良性病變HE染色如圖1所示。

a: 包裹性乳頭狀亞型(×100倍) 腫瘤有完整的纖維包膜包繞(如→所示)，可見(jiàn)經(jīng)典的乳頭狀結(jié)構(gòu) b: 包裹性濾泡亞型(×40倍) 腫瘤有完整的纖維包膜包繞(如→所示)，可見(jiàn)濾泡狀結(jié)構(gòu) c: 浸潤(rùn)性乳頭狀亞型(×100倍)腫瘤可見(jiàn)經(jīng)典的乳頭狀結(jié)構(gòu)(如所示)，在周圍甲狀腺組織(如→所示)中浸潤(rùn)性生長(zhǎng) d: 浸潤(rùn)性濾泡亞型(×100倍) 腫瘤可見(jiàn)濾泡狀結(jié)構(gòu)(如所示)，在周圍甲狀腺間質(zhì)(如→所示)中浸潤(rùn)性生長(zhǎng)

e: 結(jié)節(jié)性甲狀腺腫(×40倍)

f: 淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎(×40倍)

g: 甲狀腺濾泡性腺瘤(×40倍)

圖1甲狀腺乳頭狀癌及甲狀腺良性病變HE染色結(jié)果

1.2檢測(cè)方法

1.2.1 DNA提取 切取8 μm厚切片5張，對(duì)照最后1張HE切片選取腫瘤范圍，確保腫瘤細(xì)胞數(shù)量≥200個(gè)，使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(50) DNA提取試劑盒(QIAGEN公司，德國(guó)，Cat.No.56404,Lot No.145035990)提取基因組DNA,具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，經(jīng)核酸定量分析儀測(cè)定DNA純度及濃度。

1.2.2 基因突變檢測(cè) 采用北京雅康博公司人BRAF基因突變檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)檢測(cè)BRAF基因V600E點(diǎn)突變情況，操作按照使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用熒光定量PCR檢測(cè)儀(安捷倫MX3000P，美國(guó))按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用 SPSS 18.0軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, 對(duì)于理論頻數(shù)>5的，采用皮爾遜卡方值評(píng)價(jià) BRAF 基因突變與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的關(guān)系；對(duì)于1<理論頻數(shù)<5的，采用連續(xù)校正卡方值；對(duì)于理論頻數(shù)<1的，運(yùn)用Fisher′s精確檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

38例甲狀腺良性病變均未發(fā)現(xiàn)突變，突變率為0%；110例甲狀腺乳頭狀癌患者中93例存在BRAF V600E基因突變，突變率為84.54%，甲狀腺乳頭狀癌患者BRAF V600E基因突變率高于甲狀腺良性病變患者BRAF V600E基因突變率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。BRAF基因突變與不同性別、年齡、女性患者是否絕經(jīng)、多發(fā)病灶、直徑大小、是否伴淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎、不同組織學(xué)亞型、包裹性或浸潤(rùn)性、是否伴隨鈣化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況均無(wú)關(guān)(P>0.05)；與甲狀腺被膜外侵犯、臨床高分期有關(guān)(P<0.05)(圖2、表2)。

表1 甲狀腺良、惡性病變中BRAF基因突變率

a: 樣本擴(kuò)增曲線升起(有擴(kuò)增信號(hào))，說(shuō)明該樣本在該位點(diǎn)上發(fā)生突變，檢測(cè)結(jié)果為突變型。

b: 樣本擴(kuò)增曲線未升起(無(wú)擴(kuò)增信號(hào))，說(shuō)明該樣本在該位點(diǎn)上未發(fā)生突變，檢測(cè)結(jié)果為野生型。

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)BRAF基因V600E突變

注:*為1<理論頻數(shù)<5， 使用連續(xù)校正卡方值。

3 討論

BRAF基因?qū)儆赗AF家族成員，參與RAS-RAF-有絲分裂原活化蛋白/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(MEK)-細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)-絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，BRAF基因突變被認(rèn)為可引起上述通路持續(xù)失控，從而導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖、分化及腫瘤形成。在BRAF可識(shí)別的眾多基因突變中，最常見(jiàn)的是發(fā)生于15外顯子上第1799位核甘酸T-A的轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致編碼位于第600位纈氨酸(V)被谷氨酸(E)所替代(V600E)，從而激活了MAPK途徑，導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生[4]。BRAF V600E基因突變被認(rèn)為是甲狀腺癌發(fā)生過(guò)程中最常見(jiàn)的遺傳學(xué)事件，尤其在甲狀腺乳頭狀癌中發(fā)生率最高,達(dá)29%～88%[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)V600E點(diǎn)突變?cè)诩谞钕倭夹圆∽冎型蛔兟蕿?%，可以幫助鑒別良惡性甲狀腺乳頭狀增生的診斷[7]。本組研究中結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎及甲狀腺濾泡性腺瘤未檢測(cè)到BRAF V600E基因突變，110例甲狀腺乳頭狀癌中BRAF突變率達(dá)84.54%，這一檢測(cè)結(jié)果高于國(guó)內(nèi)外一些研究[8-9]，可能與地區(qū)差異及樣本數(shù)量有限有關(guān)。

WHO(2013)腫瘤組織學(xué)分類中，甲狀腺乳頭狀癌被定義為：顯示濾泡上皮分化特征的甲狀腺惡性上皮性腫瘤，典型者含有乳頭和濾泡結(jié)構(gòu)以及特征性的細(xì)胞核。甲狀腺乳頭狀癌病理亞型較多，其中最常見(jiàn)的是有乳頭狀結(jié)構(gòu)的經(jīng)典型及以濾泡結(jié)構(gòu)為主的濾泡亞型，鏡下根據(jù)有無(wú)完整的纖維包膜，分為包裹性及浸潤(rùn)性，間質(zhì)可有不同程度的纖維化及鈣化。王煒等[10]研究發(fā)現(xiàn)，BRAF突變?cè)诩谞钕偃轭^狀癌中的組織學(xué)表現(xiàn)更多傾向于“經(jīng)典型”和“浸潤(rùn)性”，而“濾泡亞型”和“包裹性”形態(tài)的甲狀腺乳頭狀癌則有較低的BRAF突變率，高表達(dá)RAS突變。本組BRAF突變率在濾泡亞型和經(jīng)典型、包裹性和浸潤(rùn)性及腫瘤是否伴鈣化組間未發(fā)現(xiàn)明顯差異(P>0.05)，由于病例數(shù)較少，未發(fā)現(xiàn)高細(xì)胞亞型、柱狀細(xì)胞亞型及彌漫硬化亞型等少見(jiàn)亞型。

有研究認(rèn)為合并淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎的甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較低， BRAF V600E陽(yáng)性率低，預(yù)后好于單純性甲狀腺乳頭狀癌[11-12]。本組28例(28/110)伴有淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎的甲狀腺乳頭狀癌中BRAF突變率與單純甲狀腺乳頭狀癌間無(wú)明顯差異(P>0.05)。最新的一項(xiàng)Meta分析顯示BRAF V600E 基因突變與患者的年齡、性別、腫瘤大小和甲狀腺被膜是否受侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期等有顯著相關(guān)性，它是目前公認(rèn)的甲狀腺乳頭狀癌預(yù)后的重要預(yù)測(cè)因子[13]。高分化甲狀腺癌提示預(yù)后不良的因素包括：診斷時(shí)>45歲、男性、腫瘤>4 cm和甲狀腺外浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，然而關(guān)于 BRAF V600E基因突變與 甲狀腺乳頭狀癌 的侵襲性生物學(xué)關(guān)系研究報(bào)道間還存在較多的爭(zhēng)議，秦東廣等[14]研究發(fā)現(xiàn)BRAF突變僅與腫瘤直徑大小(≥1 cm與<1 cm)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。吳永芳等[3]應(yīng)用Taqman-ARMS方法檢測(cè)106例甲狀腺乳頭狀癌中BRAF基因突變?cè)谀挲g<49歲、被膜無(wú)浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移和臨床分期Ⅰ或Ⅱ中較高(P<0.05)。洪玉蓉等[15]研究認(rèn)為BRAF突變型與野生型在中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、包膜侵犯、腫瘤數(shù)目、直徑大小、是否伴發(fā)淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎組間差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。有研究發(fā)現(xiàn)BRAF V600E點(diǎn)突變與年齡(≥45歲)，直徑≤1 cm及腫瘤被膜外侵犯有關(guān)[16]。本組BRAF突變率在性別、年齡、多發(fā)病灶、直徑大小、中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而在甲狀腺被膜外浸潤(rùn)、較高的臨床分期(Ⅲ～Ⅳ期)中，BRAF有較高的突變率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

鑒于甲狀腺乳頭狀癌有較高的BRAF突變率，在甲狀腺結(jié)節(jié)細(xì)針穿刺抽吸活檢(FNAB)的基礎(chǔ)上，結(jié)合BRAF基因檢測(cè)，已成為術(shù)前甲狀腺乳頭狀癌特異性較高的診斷方法之一，Tang等[17]報(bào)道檢測(cè)甲狀腺乳頭狀癌組織及其術(shù)前FNAB細(xì)胞的BRAF V600E基因突變，其結(jié)果符合率高達(dá)90%，由于BRAF基因突變者具有較高的復(fù)發(fā)率和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率，術(shù)前通過(guò)基因檢測(cè)還可以預(yù)測(cè)甲狀腺乳頭狀癌的臨床病理結(jié)局，方便臨床醫(yī)生在早期即可制定合理的手術(shù)方案和術(shù)后治療。

本組研究旨在初步探討甲狀腺乳頭狀癌BRAF基因突變情況，我們認(rèn)為BRAF V600E基因突變可能與甲狀腺乳頭狀癌侵襲性的生物學(xué)行為有一定相關(guān)性。

[1] 侯衛(wèi)東,胡學(xué)信,劉艷峰.甲狀腺乳頭狀癌中Cyclin D1表達(dá)和BRAF(V600E)突變的相關(guān)性及意義[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2014, 30(12):1386-1390.

[2] 林維浩,馬浙夫,夏浩明,甲狀腺乳頭狀癌BRAFV600E 突變表達(dá)及其與臨床病理特征的相關(guān)性研究[J].吉林醫(yī)學(xué),2015,36(14):2990-2992.

[3] 吳永芳,許春偉,宋業(yè)穎,等.甲狀腺癌中BRAF基因突變和RET融合基因的分子病理檢測(cè)分析[J].臨床病理雜志,2015,35(7):1361-1365.

[4] MEKEL M, NUCERA C, HODIN R A, et al. Surgical implications of BRAFV600E mutation in fine-needle aspiration of thyroid nodules[J].Am J Surg,2010,200(1):136-143.

[5] MATHUR A, MOSES W, RAHBARI R, et al. Higher rater of BRAF mutation papillary thyroid cancer over time:a single-institution study[J].Cancer,2011,117(19):4390-4395.

[6] CHAKRABORTY A, NARKAR A, MUKHOPADHYAYA R, et al. BRAFV600E mutation in papillary thyroid carcinoma:significant association with node metastases and extra thyroidal invasion[J]. Endocr Pathol,2012,23(2):83-93.

[7] 張翼,李惠,陳劼,等.BRAF基因突變檢測(cè)在甲狀腺乳頭狀病變中的臨床意義[J].中外醫(yī)療,2015,33(25):15-17.

[8] AHN H Y, CHUNG Y J, KIM B S, et al. Clinical significance of the BRAF V600E mutation in multifocal papillary thyroid carcinoma in Korea[J].Surgery,2014,155(4):689-695.

[9] 龔艷萍,龔日祥,楊敬,等. 甲狀腺乳頭狀癌 BRAF 基因突變與臨床病理特征間的關(guān)系及臨床意義[J] . 四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2013,44(4):662-665.

[10] 王煒,黎向紅,項(xiàng)晶晶,等.BRAF和RAS基因突變?cè)诩谞钕偃轭^狀癌不同組織亞型中的表達(dá)[J].中華病理學(xué)雜志,2015,44(5):331-333.

[11] 張靜,王莉,李依群.76例淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎合并甲狀腺乳頭狀癌臨床病理分析[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,31(3):259-261.

[12] 運(yùn)新偉,劉友忠,高明.甲狀腺乳頭狀癌合并橋本甲狀腺炎的臨床特征與BRAFV600E基因突變的相關(guān)性分析[J]．中華內(nèi)分泌代謝雜志,2013,29(11):931-934．

[13] XING M, ALZAHRANI A S, CARSON K A, et al. Association between BRAF mutation and mortality in patients with papillary thyroid cancer [J].JAMA,2013,309(14):1493-1501.

[14] 秦東廣,李建民,高太虎,等.BRAFV600E突變與經(jīng)典型甲狀腺乳頭狀癌患者臨床病理特征的相關(guān)性[J].腫瘤研究與臨床,2016,28(5):338-340.

[15] 洪玉蓉,羅志艷,聞卿.甲狀腺結(jié)節(jié)細(xì)針穿刺標(biāo)本BRAFV600E基因突變檢測(cè)的臨床應(yīng)用[J]. 中華超聲影像學(xué)雜志,2015, 24(8):671-674.

[16] 師藝,劉銘,馬志萍,等. 新疆地區(qū)甲狀腺乳頭狀癌中BRAFV600E基因的表達(dá)及意義[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2016,32(8):887-890.

[17] TANG K T, LEE C H. BRAF mutation in papillary thyroid carcinoma：pathogenic role and clinical implications[J].J Chin Med Assoc,2010,73(3):113-128．