楊治平， 陳曉姣， 李建波， 郭抗蕭， 嚴(yán)永旺， 楊智英

(1中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院產(chǎn)科， 長沙 410013； 2長沙衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院生物化學(xué)教研室， 長沙 410100；3中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)系, 長沙 410013)

視覺接受外界80%的信息，是人和動物的主要感覺。從上世紀(jì)60年代開始科學(xué)家就將果蠅視覺系統(tǒng)作為研究模型進(jìn)行遺傳學(xué)分析。生物學(xué)研究表明果蠅視覺系統(tǒng)的發(fā)育與脊椎動物具有共同的進(jìn)化起源[1]。果蠅和哺乳動物的視覺神經(jīng)回路非常相似，兩者都具有結(jié)構(gòu)和作用模式相似的光感受器。果蠅視覺系統(tǒng)具有精密的功能，且實驗操作方便，果蠅結(jié)構(gòu)的特殊性和作用途徑的保守性使其成為人們研究視神經(jīng)發(fā)育、突觸可塑性、軸突導(dǎo)向和神經(jīng)環(huán)路的優(yōu)秀模型。果蠅的眼睛是由750～800個結(jié)構(gòu)相同重復(fù)排列的六邊形“小/單眼”組成的復(fù)眼結(jié)構(gòu)，每個小眼中有20個細(xì)胞，其中有8個是視網(wǎng)膜感受器細(xì)胞(感光細(xì)胞,receptor cell)。果蠅的視覺系統(tǒng)具有精確的結(jié)構(gòu)及分層，果蠅成蟲的視覺系統(tǒng)包括視網(wǎng)膜(復(fù)眼)和4個視神經(jīng)節(jié)，分別為：薄板、髓質(zhì)、小葉、小葉板[2]。視網(wǎng)膜區(qū)是以小眼為基本單位構(gòu)成，每個小眼的感光細(xì)胞表達(dá)不同的rhodopsin基因，果蠅編碼7種不同的rhodopsin基因，他們分布在不同的感光細(xì)胞中感知不同的光刺激。果蠅生命周期短，易于在實驗室培養(yǎng)，成為最常用的人類疾病動物模型。2000年果蠅全基因組序列測定完成，其基因高度保守，在確認(rèn)的287個人類疾病基因中，可以比對出197果蠅同源基因，很多果蠅基因被證明是人類同源基因或腫瘤抑制基因的同源基因[3-4]。本研究利用GAL4/UAS系統(tǒng)結(jié)合視網(wǎng)膜電位(electroretinogram, ERG)快速篩選果蠅視覺系統(tǒng)功能基因。通過對隨機(jī)插入UAS系列的46株果蠅品系進(jìn)行視覺基因篩選，分離得到ERG圖譜異常的突變體，可用于人類視覺功能基因的初篩，為鑒定和研究人類視覺基因的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1果蠅品系GAL4品系ninaE-Gal4/GMR(Ⅱ)(光感受器表達(dá))、Elva-Gal4(神經(jīng)細(xì)胞表達(dá))均購自美國 Bloomington果蠅中心；實驗中使用的UAS果蠅品系及W1118均由美國麻省大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系Li實驗室提供。本研究所有果蠅均在22℃～25℃環(huán)境下培養(yǎng)，培養(yǎng)基為標(biāo)準(zhǔn)的玉米粉-糖蜜-酵母培養(yǎng)基。

1.2方法

1.2.1 果蠅雜交

1.2.1.1 構(gòu)建ninaE-Gal4/+;W1118/+果蠅 將ninaE-Gal4雄性果蠅與W1118處女蠅雜交，收取其F1代，得到ninaE-Gal4/+;W1118/+目的果蠅，后者為本研究正常對照果蠅。

1.2.1.2 構(gòu)建ninaE-Gal4/UAS候選基因RNAi果蠅 將攜帶UAS因子的46株果蠅(挑選處女蠅)與ninaE-Gal4雄性果蠅分別進(jìn)行雜交，收取其F1代，得到ninaE-Gal4/UAS系列的RNAi果蠅。

1.2.1.3 構(gòu)建Elva-Gal4/UAS候選基因RNAi果蠅 將攜帶UAS因子的46株果蠅(挑選處女蠅)與Elva-Gal4雄性果蠅分別進(jìn)行雜交，收取其F1代，得到Elva-Gal4/UAS系列的RNAi果蠅。

1.2.2 數(shù)據(jù)采集 用JSM-6360掃描電子顯微鏡觀察目的果蠅成蟲復(fù)眼外形結(jié)構(gòu)。記錄ERG：用膠帶將需要檢測果蠅輕輕地粘在塑料板上，身體傾斜45°左右，小心將導(dǎo)電溶液均勻投抹于果蠅眼睛和背部，參比電極放置于果蠅背部，同時記錄電極放置于果蠅眼睛表面，通過給光、去光刺激視網(wǎng)膜，細(xì)胞內(nèi)電位計檢測視網(wǎng)膜電位，記錄所得實驗結(jié)果并進(jìn)行分析，分析果蠅眼睛對光刺激的光感受變化。

2 結(jié)果

2.1獲得ninaE-Gal4/UAS和Elva-Gal4/UAS系統(tǒng)的RNAi果蠅觀察獲取的系列RNAi果蠅復(fù)眼外形，正常對照組果蠅復(fù)眼結(jié)構(gòu)完整，紋路清晰(圖1a)。大部分RNAi果蠅復(fù)眼外形正常，但少部分RNAi果蠅復(fù)眼外形出現(xiàn)異常，其中Gal4/UAS RTF1 RNAi果蠅、Gal4/UAS Sas-4 RNAi果蠅單眼結(jié)構(gòu)清楚，但部分區(qū)域剛毛稀少、剛毛短且有折斷(圖1b、c)；Gal4/UAS So RNAi果蠅部分區(qū)域結(jié)構(gòu)異常隆起，剛毛稀少，剛毛短且有折斷(圖1d)；Gal4/UAS DLG RNAi果蠅 、Gal4/UAS CG14591 RNAi果蠅復(fù)眼完全塌陷、眼睛結(jié)構(gòu)完全破壞，結(jié)構(gòu)不完整，單眼不清楚，剛毛非常稀少且有折斷(圖1e、f)。

2.2RNAi果蠅ERG檢測大部分RNAi果蠅ERG檢測正常，共篩選出5類異常ERG圖譜。正常對照組果蠅ERG顯示在給光、去光刺激時視網(wǎng)膜電位呈現(xiàn)明顯改變，且振幅一致(圖2a)；Gal4/UAS DLG RNAi 果蠅ERG顯示給光、去光刺激視網(wǎng)膜電位無改變，對光刺激顯示沒有反應(yīng)(圖2b)；Gal4/UAS RTF1 RNAi 果蠅ERG顯示去光刺激視網(wǎng)膜電位改變不明顯(圖2c)；Gal4/UAS Sas-4 RNAi果蠅 ERG顯示去光刺激視網(wǎng)膜電位改變不明顯，振幅降低(圖2d)；Gal4/UAS CG14591 RNAi 果蠅ERG結(jié)果顯示給光、去光刺激視網(wǎng)膜電位改變非常不明顯，振幅明顯降低(圖2e)；Gal4/UAS So RNAi 果蠅ERG結(jié)果顯示給光刺激時視網(wǎng)膜電位改變不明顯，振幅降低(圖2f)。這些異常ERG結(jié)果顯示視網(wǎng)膜對給光、去光刺激反應(yīng)出現(xiàn)明顯異常，眼睛功能受到一定程度影響。

2.3篩選結(jié)果對GAL4/UAS系統(tǒng)雜交產(chǎn)生的ninaE-Gal4/UAS RNAi果蠅和Elva-Gal4/UAS RNAi果蠅進(jìn)行ERG檢測，得到相應(yīng)的視網(wǎng)膜電位圖，根據(jù)視網(wǎng)膜電位檢測結(jié)果并結(jié)合復(fù)眼表面結(jié)構(gòu)篩選出果蠅視覺系統(tǒng)功能基因5種，見表1。

a: 對照果蠅眼正常(×200)

b、c: 果蠅復(fù)眼結(jié)構(gòu)正常，剛毛稀疏

d: 果蠅復(fù)眼局部隆起，剛毛稀疏

e、f: 果蠅視網(wǎng)膜變性，復(fù)眼完全塌陷、眼睛結(jié)構(gòu)完全破壞，感受器結(jié)構(gòu)不完整

圖1果蠅復(fù)眼外形

a: 對照組反應(yīng)正常，視網(wǎng)膜電位明顯改變，振幅一致

b: 不正常，給光、去光刺激視網(wǎng)膜電位無改變，對光刺激顯示沒有反應(yīng)

c: 不正常，去光刺激視網(wǎng)膜電位改變

d: 不正常，去光刺激視網(wǎng)膜電位改變不明顯，振幅降低

e: 不正常，給光、去光刺激視網(wǎng)膜電位改變非常不明顯，振幅明顯降低

f: 不正常，給光刺激時視網(wǎng)膜電位改變不明顯，振幅降低

圖2果蠅ERG檢測

3 討論

GAL4/UAS二元表達(dá)系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于黑腹果蠅、小鼠和植物的基因功能研究，且遺傳操作實驗效率高、重復(fù)性好。GAL4系統(tǒng)受特定組織特異性增強(qiáng)子或/和啟動子驅(qū)動，表現(xiàn)出特異的時空表達(dá)模式，此外該系統(tǒng)還能用于在體過表達(dá)或基因沉默。UAS是GAL4的結(jié)合區(qū)域，當(dāng)與GAL4結(jié)合的時候可以驅(qū)動UAS下游基因的表達(dá)，啟動該基因轉(zhuǎn)錄和翻譯；而在結(jié)合位置空白的時候，則使UAS下游基因保持沉默[5]。GAL4驅(qū)動者品系和UAS目的基因品系獨(dú)立存在，二者可以多種組合方式，可以通過雜交在特定組織表達(dá)或沉默不同的基因，也可以在不同組織表達(dá)或沉默同一基因，這極大地豐富了研究的范圍，為探討基因和蛋白功能提供了多種途徑[6]。本文分別構(gòu)建了46株ninaE-Gal4/UAS(光感受器)和Elva-Gal4/UAS(神經(jīng)細(xì)胞)基因RNAi果蠅，獲取因功能喪失(loss of function)后引起一系列表型改變的果蠅，從而從46種基因中找到與視覺功能直接相關(guān)的基因。

表1 異位表達(dá)時引起ERG異常的UAS品系

在檢測的GAL4/UAS RNAi品系果蠅中，本研究共發(fā)現(xiàn)有5種RNAi品系果蠅復(fù)眼外形結(jié)構(gòu)和ERG圖譜異常(ninaE-Gal4/UAS和Elva-Gal4/UAS品系均出現(xiàn)異常)。研究結(jié)果表明果蠅相關(guān)功能基因功能喪失引起異常表型，需要進(jìn)一步研究這些相關(guān)基因的功能。目前，也有文獻(xiàn)報道利用GAL4/UAS系統(tǒng)進(jìn)行基因功能研究。Vinatier等[7]利用GAL4系，將引起人類脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)的多聚谷氨酰胺在果蠅復(fù)眼中表達(dá)，觀察到和人類病理特征相同的核包涵體的出現(xiàn)以及細(xì)胞退化，證實人類和無脊椎動物之間多聚谷氨酰胺重復(fù)致病機(jī)理的一致性。Atkins等[8]利用GAL4系在翅膀和觸覺器等處將ey基因異位表達(dá)，發(fā)現(xiàn)正常發(fā)育的眼在異位形成，該眼含有整套感光細(xì)胞和分化完全的小眼，這證實ey是調(diào)控黑腹果蠅復(fù)眼發(fā)育的主要基因。Tabuchi等[9]運(yùn)用WGA與肌肉特異性GAL4驅(qū)動器組合在果蠅中追蹤突觸神經(jīng)通路的應(yīng)用，他們認(rèn)為GAL4/UAS-WGA系統(tǒng)在研究解剖果蠅神經(jīng)回路的形成和突觸發(fā)育階段功能基因的研究中起重要作用。Sandrelli等[10]利用GAL4/UAS-nonA表達(dá)并結(jié)合ERG分析該基因在正常視力、求偶歌曲中的作用。

GAL4/UAS二元表達(dá)方法也有缺陷，可能發(fā)現(xiàn)在所感興趣的組織非正常表達(dá)的基因，只有對篩選的基因進(jìn)一步詳細(xì)分析后才能確認(rèn)篩選出的果蠅視覺基因是否成功。在果蠅視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞和光感受器篩選出的5種視覺相關(guān)基因，還需要檢測它們的基因敲除突變體，進(jìn)一步分析研究這些基因?qū)黾游覀儗σ曈X圖譜發(fā)育的了解。同時，還需要摒棄GAL4/UAS系統(tǒng)可能造成的假陽性和假陰性結(jié)果，如GAL4蛋白的表達(dá)量不足以激活UAS目的基因，就會導(dǎo)致后者出現(xiàn)表達(dá)滯后現(xiàn)象；如GAL4蛋白不能得到及時清除降解，就會導(dǎo)致激活時間延長，這些都會影響基因功能分析和時間效應(yīng)評價。本研究獲得ninaE-Gal4/UAS和Elva-Gal4/UAS 2種品系，進(jìn)一步對篩選結(jié)果進(jìn)行比較，獲得引起果蠅眼睛表型異常的有DLG、RTF1、Sas-4、So、CG14591。果蠅的眼睛與人類不同，但最基本的結(jié)構(gòu)和功能有許多相似之處。青光眼是導(dǎo)致完全失明的第二大病因，其由于視網(wǎng)膜變性所導(dǎo)致的完全失明不可逆轉(zhuǎn)，目前尚無有效療法。從長遠(yuǎn)來看，視網(wǎng)膜再生能給他們恢復(fù)視力、重見光明帶來希望。對光感受器功能基因的篩選和研究，可能有助于研究視網(wǎng)膜再生，為視網(wǎng)膜變性失明患者帶來希望[11-12]。本研究通過篩選雖然獲得引起視覺異常的分子，但是這些基因的功能及作用機(jī)制仍然不清楚，需要進(jìn)一步鑒定這些基因并確定這些基因在視覺系統(tǒng)中的角色。這些研究結(jié)果可用于人類視覺功能基因的初篩，為研究這些基因的功能積累資源并為臨床應(yīng)用提供有意義的參考。

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