付程凱, 李建民, 趙宏濤， 劉俊杰， 趙雅寧， 李雪梅， 梁文吉

(華北理工大學(xué)1臨床醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心； 2附屬醫(yī)院神經(jīng)外科； 3護(hù)理與康復(fù)學(xué)院社區(qū)護(hù)理教研室， 河北 唐山 063000)

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是臨床上常見(jiàn)的神經(jīng)外科疾病，具有極高的傷殘率和致死率。盡管目前在SAH診斷、臨床手術(shù)治療和影像放射等方面取得了進(jìn)展，SAH患者死亡率有所下降，但存活者預(yù)后情況仍不容樂(lè)觀[1]。傳統(tǒng)研究認(rèn)為SAH后的腦血管痙攣(CVS)是引起遲發(fā)性腦出血(DCI)和不良預(yù)后的主要原因。對(duì)SAH如何預(yù)防、控制已進(jìn)行大量的研究，但結(jié)果并不理想，并未有效改善患者預(yù)后。而目前研究發(fā)現(xiàn)，減少早期腦部神經(jīng)細(xì)胞的損傷和死亡是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵[2]。Edaravone是一種強(qiáng)效的氧自由基清除劑，廣泛用于SAH患者的治療中。臨床研究顯示SAH患者Edaravone治療組預(yù)后頭痛癥狀和腦膜刺激征的改善明顯優(yōu)于對(duì)照組，且無(wú)不良反應(yīng)，對(duì)SAH患者有明顯腦保護(hù)作用[3]。也有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)Edaravone可抑制SAH大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減輕其早期腦損傷[4-5]。但Edaravone在SAH的治療中具體的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制尚不明確。有文獻(xiàn)報(bào)道自噬在SAH后的神經(jīng)損傷與保護(hù)中起重要的作用[6]，自噬是真核細(xì)胞在生理或病理因子作用下通過(guò)自噬體和溶酶體融合的途徑對(duì)受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)進(jìn)行識(shí)別、降解的一種現(xiàn)象，是除凋亡、壞死以外的第三種細(xì)胞死亡方式[7]。目前研究認(rèn)為自噬是一把雙刃劍，適度的自噬具有神經(jīng)保護(hù)作用，而過(guò)度激活的自噬可能加速神經(jīng)細(xì)胞的死亡。關(guān)于Edaravone是否可以調(diào)控SAH后自噬的表達(dá)，目前未見(jiàn)報(bào)道。自噬的激活及調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，涉及PIK3、MAPK、ERK1/2、JNK和P38等多條信號(hào)通路[8]。本研究擬選擇ERK1/2信號(hào)通路，觀察Edaravone對(duì)SAH后神經(jīng)細(xì)胞自噬的影響，并探討其可能的分子途徑。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量350～450 g[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)SCXK(京)2009-003]。動(dòng)物房溫度 24～26℃，相對(duì)濕度40%～60%，飼養(yǎng)期間大鼠自由進(jìn)食水，保證充足的飼料和飲水，大鼠適應(yīng)環(huán)境1 w后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。利用隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、蛛網(wǎng)膜下腔出血模型組(SAH組)、Edaravone治療組(Edaravone組)、ERK1/2抑制劑干預(yù)組(U0126組)，每組10只，術(shù)前禁食水12 h。

1.2主要試劑和儀器兔抗beclin-1單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)，DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，二甲亞砜溶劑(DMSO，美國(guó)Sigma公司)，GADPH(武漢博士德生物工程有限公司)，大鼠腦立體定位儀(上海奧爾科特生物科技有限公司)，OLYMPUS攝像顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，圖像采集及分析系統(tǒng)(北京航空航天大學(xué))，酶標(biāo)儀(北京普天新橋技術(shù)有限公司)，電泳儀(北京東方儀器廠)，電轉(zhuǎn)槽(瑞典Phmarcia公司)，Gel-Doc凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)，PBS緩沖液，枸櫞酸鹽緩沖液。

1.3SAH大鼠模型制作及給藥方法動(dòng)物模型的制備：采用血管內(nèi)穿刺[9]的方法復(fù)制SAH模型,大鼠用質(zhì)量濃度為100 g/L的水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，頸部剃毛，消毒，沿頸部中線剪開(kāi)暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈分叉。血管夾阻斷頸外動(dòng)脈，于血管夾近端剪斷頸外動(dòng)脈；將4-0單股尼龍線插入頸內(nèi)動(dòng)脈，從頸總動(dòng)脈分叉開(kāi)始，刺破大腦中動(dòng)脈和大腦前動(dòng)脈分叉處，停留15 s撤出，縫合傷口。Sham組在穿刺線刺入時(shí)感到阻力退出，不刺破大腦中動(dòng)脈和大腦前動(dòng)脈分叉，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。

麻醉清醒后，單籠飼養(yǎng)。Edaravone組通過(guò)腹腔給藥干預(yù)，常規(guī)SAH造模術(shù)后以5 mg/kg給予Edaravone腹腔注射，12 h后重復(fù)給藥1次，直至24 h處死。U0126組于造模前30 min前經(jīng)尾靜脈注射U0126，給藥劑量為0.05 mg/kg，Sham組與SAH組注射等體積生理鹽水。

1.4HE染色每組隨機(jī)選取5只大鼠，在模型制造成功后24 h處死，用4%多聚甲醛灌注然后取腦，在30 min內(nèi)及時(shí)固定，用酒精做脫水劑脫水透明；常規(guī)石蠟包埋，切片，貼片；梯度酒精水化，脫蠟染色；脫水透明，滴加中性樹(shù)膠，加蓋玻片，封固切片。每只大鼠海馬CA1區(qū)取6個(gè)不完全重疊的視野，在光學(xué)顯微鏡(400倍)下觀察視野內(nèi)的細(xì)胞形態(tài)。應(yīng)用Motic-6.0圖像采集及圖像分析系統(tǒng)觀察計(jì)數(shù)高位視野下的存活與壞死神經(jīng)細(xì)胞數(shù)。

1.5免疫組織化學(xué)染色標(biāo)本采集同HE染色，切片常規(guī)脫蠟、水化，3%過(guò)氧化氫封閉10 min，高壓熱修復(fù)抗原90 s，分別滴加磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)、LC3-Ⅱ及beclin-1抗體(1∶200稀釋)，濕盒中37℃孵育30 min，然后滴加二抗(1∶400)，37℃恒溫箱孵育40 min，DAB顯色、脫水、透明，中性樹(shù)膠封片，于400倍光鏡下觀察并攝片，每張切片在海馬CA1區(qū)隨機(jī)選取5個(gè)視野，運(yùn)用Image Pro Plus 6.0進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)并測(cè)量平均A值，對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1HE染色結(jié)果Sham組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)完整，海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常且有序，數(shù)量較多，核仁清晰可見(jiàn)，胞核未固縮破裂。同Sham組比較，SAH組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞變性、水腫、腫脹，形成空泡結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核邊界形狀不規(guī)則，出現(xiàn)核固縮破裂溶解，神經(jīng)細(xì)胞大量損傷，數(shù)量較少(P<0.05)。同SAH組比較，Edaravone組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較SAH組明顯增多(P<0.05)，形態(tài)有所恢復(fù)，接近正常；U0126組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)整，細(xì)胞損傷加重，細(xì)胞數(shù)量較SAH組明顯減少(P<0.05)。HE染色結(jié)果見(jiàn)圖1，細(xì)胞計(jì)數(shù)分析見(jiàn)表1。

Sham組

SAH組

Edaravone組

U0126組

圖1 各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞HE染色(HE×400)

注：與Sham組比較，*P<0.05； 與SAH組比較，△P<0.05。

2.2各組大鼠海馬區(qū)beclin-1、LC3-Ⅱ、p-ERK1/2的表達(dá)beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞胞質(zhì)，陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)中可見(jiàn)大量棕黃色顆粒。與Sham組比較，SAH組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增多(P=0.000)；與SAH組比較，Edaravone組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增多(P=0.000)、U0126組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P=0.000)。

陽(yáng)性p-ERK1/2主要定位于細(xì)胞核，少數(shù)表達(dá)在細(xì)胞漿,陽(yáng)性細(xì)胞染色呈棕黃色。Sham組大鼠陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較少，與Sham組比較，SAH組p-ERK1/2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較多(P=0.000)。與SAH組比較，Edaravone組p-ERK1/2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)量明顯增加(P=0.000)、U0126組p-ERK1/2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)量明顯減少(P=0.000),見(jiàn)圖2、表2。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Edaravone治療可使SAH大鼠存活神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，提示其具體有神經(jīng)保護(hù)作用。劉宏雅[10]在腦出血患者應(yīng)用Edaravone治療和常規(guī)治療的對(duì)照中，發(fā)現(xiàn)其可以延緩神經(jīng)細(xì)胞死亡和神經(jīng)功能障礙，改善腦功能，提高腦出血患者的生活質(zhì)量；彭秉綱等[11]和滕秀涵[12]應(yīng)用Edaravone對(duì)腦出血患者治療后發(fā)現(xiàn)其具有保護(hù)患者腦神經(jīng)細(xì)胞、促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的作用。本研究結(jié)果與眾多研究結(jié)果一致，但其具體的保護(hù)機(jī)制尚未闡明。自噬性死亡又稱(chēng)Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡(CDP)，是細(xì)胞的一種自我降解途徑，真核細(xì)胞在自噬相關(guān)基因調(diào)控下，通過(guò)自身溶酶體作用而降解細(xì)胞生物大分子、細(xì)胞器，以維持細(xì)胞的生長(zhǎng)分化和穩(wěn)定的過(guò)程。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)自噬導(dǎo)致beclin-1和LC3-II蛋白表達(dá)異常增強(qiáng)，應(yīng)用Edaravone治療后其自噬蛋白表達(dá)量明顯增加。周波等[13]建立帕金森病(PD)小鼠腦細(xì)胞自噬模型，利用Edaravone對(duì)其進(jìn)行治療后發(fā)現(xiàn)小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞beclin-1和LC3-II蛋白表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組明顯增加，且神經(jīng)細(xì)胞死亡率下降；徐繼偉等[4]在建立的SAH模型中應(yīng)用Edaravone治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LC3-II、beclin-1表達(dá)顯著增加，大鼠抓力恢復(fù)明顯，神經(jīng)損傷下降。本研究結(jié)果與此結(jié)果一致，說(shuō)明Edaravone能夠上調(diào)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，適度激活自噬，保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞，減少神經(jīng)細(xì)胞的損傷，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

表2 各組大鼠海馬區(qū)Beclin-1、LC3-Ⅱ和p-ERK1/2蛋白表達(dá)

注：與Sham組比較，*P<0.05；與SAH組比較，△P<0.05。

圖2各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞beclin-1、LC3-Ⅱ、p-ERK1/2的表達(dá)

ERK1/2是MAPK家族中的一類(lèi)，其信號(hào)通路是最經(jīng)典的MAPK信號(hào)通路，為三級(jí)激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，即Ras-Raf-MEK-ERK1/2通路。當(dāng)Ras受到外界鳥(niǎo)苷酸交換因子(GEF)刺激時(shí)可與三磷酸鳥(niǎo)苷(GTP)結(jié)合成為激活肽，GTP-Ras可以磷酸化Raf進(jìn)而活化MEK/ERK[14]。而U0126是ERK1/2信號(hào)蛋白的特異性阻滯劑，可以有效地抑制ERK1/2磷酸化過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與SAH組相比較，U0126組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量降低，ERK1/2信號(hào)通路明顯被抑制。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，Edaravone治療組p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，同時(shí)自噬水平也明顯被上調(diào)。說(shuō)明ERK1/2通路與自噬的激活之間存在正反饋循環(huán)，ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活能降低神經(jīng)細(xì)胞自噬水平的表達(dá)。楊淑娟等[15]對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞應(yīng)用碧蘿芷下調(diào)ERK1/2磷酸化水平后，自噬水平也明顯被抑制，細(xì)胞損傷加重；劉俊杰等[16]對(duì)SAH大鼠早期腦損傷應(yīng)用MEK的特異性阻滯劑U0126抑制ERK1/2信號(hào)通路后，大鼠自噬水平下降，腦損傷加重。綜上所述，認(rèn)為Edaravone可以通過(guò)ERK1/2信號(hào)蛋白的磷酸化適度提高神經(jīng)細(xì)胞自噬的表達(dá)水平，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

目前研究認(rèn)為SAH后的腦血管痙攣(CVS)并非發(fā)生遲發(fā)性腦缺血(DCI)和遲發(fā)性缺血性腦損傷(NIND)的先決條件，而SAH后的早期腦損傷(EBI)則被認(rèn)為是參與NIND發(fā)生的重要原因[2]，而自噬在SAH后EBI中起保護(hù)作用，可以緩解EBI中的病理生理進(jìn)程[17]，但是目前對(duì)SAH后自噬的研究?jī)H涉及到復(fù)雜的病理過(guò)程中的一小部分。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)Edaravone可以激活ERK1/2信號(hào)蛋白，適度地提高了自噬的水平，進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，以期為改善SAH患者預(yù)后和探索自噬在SAH中的作用提供方法和思路。

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