劉慶權(quán) 榮 陽 劉曉華

（1 遼寧省遼陽市新城醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧 遼陽 111000；2 遼寧省遼陽市中心醫(yī)院醫(yī)務(wù)處，遼寧 遼陽 111000；3 遼寧省遼陽市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧 遼陽 111000）

侵襲性大腸埃希菌（EIEC）是一種腸道侵襲性細(xì)菌，到目前已發(fā)現(xiàn)有12個(gè)“O”血清型，一些曾引起過腹瀉的流行。目前的研究認(rèn)為，EIEC的毒力取決于其侵入細(xì)胞的能力，其侵襲力與細(xì)菌的外膜蛋白有關(guān)，國外同仁先后證實(shí)EIEC的侵襲性質(zhì)粒分子量為120～140 Md，該質(zhì)?？删幋a15種以上外膜蛋白，控制多種毒力因子，其中毒力蛋白IPaC是與侵襲過程中不可缺少的外膜蛋白[1]。所以本實(shí)驗(yàn)選擇ipaC為靶基因，用基因工程的方法構(gòu)建其重組表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)并純化毒力蛋白IpaC，為IpaC功能的研究奠定基礎(chǔ)，從而進(jìn)一步了解EIEC的發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料：質(zhì)粒和菌株：EIEC、大腸桿菌BL21（λDE3）、表達(dá)質(zhì)粒PET32a為本院檢驗(yàn)科保存。主要試劑：QIAexpressionisTM蛋白純化系統(tǒng)為德國QIA-GEN公司產(chǎn)品；異丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）為華美生物工程公司產(chǎn)品；咪唑購自Sigma公司；其他主要生化試劑為美國Sigma公司產(chǎn)品或國內(nèi)AR級(jí)產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化與基因產(chǎn)物的表達(dá)：將表達(dá)質(zhì)粒Pet32a-ipaC轉(zhuǎn)化用氯化鈣處理法得到的感受態(tài)大腸桿菌EL21（λDE3），將轉(zhuǎn)化液涂于含氨芐青霉素的LB平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落接種于20 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min振搖過夜。取3 mL過夜培養(yǎng)物接種入100 mL的含氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中，37 ℃以200 r/min振搖，測(cè)定A600值，直至A600值到達(dá)0.4～0.5（勿超過0.6）。加入IPTG（終濃度為0.4 μmol/L）進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)4 h后收菌。將菌液在4 ℃、5000 g、離心5 min，棄上清。將沉淀物用Lysis buffer液懸浮，反復(fù)凍融幾次后，在冰浴中以中等強(qiáng)度超聲破菌，每次45 s，每次間隔45 s，共10次。破菌后，4 ℃、15000 g，離心25 min，收集上清液備用。沉淀用同樣的Lysis buffer溶解備用。

1.2.2 表達(dá)產(chǎn)物的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酞胺凝膠電泳（SDSPAGE）檢測(cè)：收集IPTG誘導(dǎo)前與誘導(dǎo)后4 h的菌液各l mL，高速離心后分別用100 μL TE緩沖液懸浮、超聲破菌離心后分別取上清和沉淀各100 μL，在上述樣品中各加入100 μL的上樣緩沖液混勻，100 ℃水浴3 min，點(diǎn)樣，25 mA恒流通電進(jìn)行SDS-PAGE。電泳后以考馬斯亮藍(lán)染色30 min，然后用脫色液脫色，觀察結(jié)果。

1.2.3 表達(dá)產(chǎn)物的純化：采用蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行純化，操作方法按照說明書進(jìn)行。用1 mL的resin slurry和4 mL的超聲破菌后上清充分混合，200 rpm，4 ℃，60 min。將混合液過濾，收集流出液。4 mL wash buffer洗滌3次，并分別收集洗滌液。0.5 mL Eluton buffer洗脫4次，并分別收集洗滌液。將上述的收集液分別進(jìn)行SDS-PAGE分析，觀察蛋白純化結(jié)果。將純化后的蛋白在凍干機(jī)中凍干，保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒毒力蛋白IpaC的導(dǎo)誘表達(dá)以及表達(dá)產(chǎn)物的鑒定分析：將重組質(zhì)粒pET32a-iPaC轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（λDE3），在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)，分別對(duì)誘導(dǎo)前后的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE及考馬斯亮藍(lán)染色，可在相對(duì)分子量63KD處見一明顯的誘導(dǎo)表達(dá)帶。對(duì)此誘導(dǎo)表達(dá)帶進(jìn)行黑度密度自動(dòng)掃描分析，此處表達(dá)蛋白量約占總菌體蛋白量的13%。

2.2 重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物的可溶性鑒定以及純化結(jié)果：將超聲破菌后上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)目的蛋白同時(shí)存在于上清和沉淀中，表明該目的蛋白的表達(dá)有部分為可溶性表達(dá)，還有一部分蛋白形成了包涵體。如果僅從上清中提取目的蛋白，既可保證蛋白的天然活性，還可免去蛋白復(fù)性這一步，簡化了純化的過程。對(duì)純化的蛋白進(jìn)行黑度密度自動(dòng)掃描分析，蛋白的純度達(dá)到90%以上。

3 討 論

EIEC是一種腸道侵襲性細(xì)菌，它侵入腸上皮細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)繁殖引起細(xì)胞變性，使腸上皮出現(xiàn)損傷，導(dǎo)致黏膜固有層發(fā)生炎癥、潰瘍、出血，但是具體的發(fā)病機(jī)制并不十分清楚。EIEC介導(dǎo)侵襲的基因位于大質(zhì)粒一個(gè)25 kb的BamHl片段上[2]。該質(zhì)?？删幋a一組侵襲性毒力蛋白（IPa），它們分別是IpaA、IpaB、IpaC、IpaD，是細(xì)菌侵入腸上皮細(xì)胞所必需的。IPa蛋白抗體有被動(dòng)免疫保護(hù)性作用，可阻斷EIEC侵入腸上皮細(xì)胞，細(xì)菌不能侵入腸上皮細(xì)胞，即不具有毒性，說明IPa蛋白在抗感染過程中有重要作用[3]。

本實(shí)驗(yàn)選擇的pET表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)是近年來出現(xiàn)的一種含T7啟動(dòng)子的原核表達(dá)系統(tǒng)，該系列質(zhì)粒中含有腳啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)、氨節(jié)青霉素抗性基因、表達(dá)產(chǎn)物的N端和（或）C端含有6個(gè)連續(xù)的組氨酸等。其中T7啟動(dòng)子可高效表達(dá)外源蛋白，所表達(dá)的外源蛋白質(zhì)量一般占總蛋白量的25%以上，甚至達(dá)到細(xì)菌總蛋白量的50%[4]。采用Ni-NIA鰲合層析介質(zhì)，以咪唑洗脫表達(dá)的外源蛋白。純化過程非常簡便，而且純化蛋白的純度可達(dá)到90%以上。所以該蛋白純化體系是一種簡便、高效的純化系統(tǒng)[5]。

因此，本實(shí)驗(yàn)選擇EIEC毒力質(zhì)粒編碼的侵襲性毒力蛋白基因（IpaC）作為研究對(duì)象，利用基因工程的方將該基因定向克隆到原核高效表達(dá)質(zhì)粒pET32a中，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21（λDE3），從而穩(wěn)定、高效地表達(dá)毒力蛋白IpaC?？蛇M(jìn)一步研究該毒力蛋白的生化特性及免疫學(xué)功能，并進(jìn)行體內(nèi)外侵襲性功能研究，可以更好地了解EIEC的發(fā)病機(jī)制。

[1] 慕容洋洋,邊彤,蘇寧.侵襲性大腸埃希氏菌IpaC的表達(dá)和純化與臨床檢驗(yàn)學(xué)研究[J].中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志,2015,38(1):33-36.

[2] 朱忠勇.實(shí)用醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2008:301-309.

[3] 龍官保,劉華,蘇暢.侵襲性大腸桿菌實(shí)驗(yàn)研究[J].中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志,2015,38(1):161-163.

[4] 徐建國.分子醫(yī)學(xué)細(xì)菌學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,2008:145-149.

[5] 梁國棟.最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京.科學(xué)出版社,2008:282-288.