許 杰，鄧 威，李 軍，薛淑霞，馬文婷，霍文慧

（天津市水生動物疫病預(yù)防控制中心，天津 300221）

蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）2009年首次在泰國生長緩慢的養(yǎng)殖斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）中被分離而命名[1]，是一種高傳染性細胞內(nèi)寄生的微孢子蟲，近年來在泰國、印度、越南、馬來西亞、印度尼西亞和中國等主要對蝦養(yǎng)殖國家中流行，主要感染凡納濱對蝦（Penaeus vannamei）和斑節(jié)對蝦等養(yǎng)殖蝦類，可導(dǎo)致對蝦生長極其緩慢或停滯，是影響全球?qū)ξr養(yǎng)殖生產(chǎn)的重要疾病之一[2]。

自2013年以來，我國沿海對蝦養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)先后發(fā)現(xiàn)有EHP流行，且檢出率有增加趨勢。2015年遼寧省營口市、盤錦市的對蝦EHP檢出率達34.6%[3]；粵西地區(qū)87份凡納濱養(yǎng)殖對蝦樣品的EHP檢出率為41.38%[4]；2015年浙江省舟山市大棚養(yǎng)殖的凡納濱對蝦普遍出現(xiàn)生長緩慢、養(yǎng)殖成功率低等現(xiàn)象，采集的270份病蝦樣本中，EHP檢出率高達85.19%[5]。本文就該病的流行病學(xué)及檢測技術(shù)等做一概述，以期為對蝦養(yǎng)殖病害防控提供技術(shù)參考。

1 分類地位及特性

微孢子蟲種類繁多，廣泛寄生于節(jié)肢動物和魚類體內(nèi)。由孢子形成的單細胞寄生蟲，其孢子呈梨形、橢圓形、茄形等，孢子長2～10 μm。微孢子蟲主要寄生于對蝦的肌肉和肝胰腺內(nèi)，有時也寄生在心臟、胃、腸、鰓等處，感染嚴重時可引起病蝦死亡，甚至大批死亡[6]。早期發(fā)現(xiàn)寄生于對蝦體內(nèi)的微孢子蟲屬于微粒子蟲屬（Ameson）、八孢子蟲屬（Agmasoma）和匹里蟲屬（Pleistophora）[3]。Han等[7]發(fā)現(xiàn)一種可感染馬達加斯加、莫桑比克和沙特阿拉伯地區(qū)白對蝦和斑節(jié)對蝦的新微孢子蟲（Perezia sp.），在對蝦肌肉、肝胰腺、鰓、心臟和淋巴器官組織中有細胞質(zhì)內(nèi)含物和成熟孢子，受感染蝦的尾部呈現(xiàn)不透明或白色。在對蝦疾病中，微孢子蟲病是由原生動物所引起的對蝦病害中較為嚴重的一種。

EHP隸屬于微孢子蟲目（Microsporidia）、微孢子蟲科（Nosematidae）、腸胞蟲屬（Enterocytozoon），是一種個體較小的微孢子蟲，可在對蝦細胞內(nèi)形成對自身起保護作用的孢原質(zhì)。EHP從早期孢子的孢原質(zhì)到成熟孢子都在宿主細胞的細胞質(zhì)中生長發(fā)育。多核的孢子孢原質(zhì)表面有許多液泡，在早期的孢原質(zhì)發(fā)育過程中發(fā)生了孢原質(zhì)細胞核二分裂，在孢原質(zhì)中形成了大量前孢子細胞。在孢原質(zhì)表面形成早期孢子之前，孢原質(zhì)在細胞質(zhì)中形成電子致密盤和極管的前體。成熟孢子呈橢圓形，大小0.7 μm×1.1 μm，包含1個細胞核、5～6圈極絲、1個后液泡、1個附著在極絲上的固著盤，以及厚的高電子密度胞壁。胞壁由原生質(zhì)膜、低電子密度孢子內(nèi)壁（10 nm）和高電子密度孢子外壁（2 nm）組成[1]。

2 感染宿主和傳播途徑

對蝦多通過捕食被微孢子蟲寄生的其他動物而感染，所以微孢子蟲常在野生對蝦中發(fā)生，如褐對蝦（Penaeus agtecus）和白對蝦（Penaeus setiferus）等[8-9]。我國在養(yǎng)殖的日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicus）、凡納濱對蝦、羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）中也檢出了EHP[10]。

EHP的傳播途徑有兩種：一種是垂直傳播，即通過親蝦傳播給子代；另一種是水平傳播，經(jīng)口攝食寄生EHP的鮮活餌料、病蝦、死蝦或環(huán)境中的孢子體而感染[11]。EHP感染對蝦后，先在肝胰腺細胞內(nèi)形成孢原質(zhì)，待孢子成熟后，再通過對蝦消化道排出體外，然后散于水體并附著于藻類、碎屑、飼料表面，以及池壁和底泥環(huán)境中，成為健康對蝦的潛在威脅。通過肌肉注射、口服、與EHP陽性蝦同池飼養(yǎng)等途徑，對健康蝦進行EHP感染試驗[12]，發(fā)現(xiàn)該寄生蟲具有非常強的傳染性，可通過多途徑傳播，能在蝦的消化器官細胞內(nèi)大量繁殖，吸收營養(yǎng)，從而影響肝胰腺和腸道的正常消化吸收功能，使被寄生的蝦類生長發(fā)育受阻礙，嚴重時可導(dǎo)致其生長停止。

3 癥狀及病理變化

對蝦感染EHP后不表現(xiàn)出明顯的疾病癥狀，攝食正常，腸胃充滿食物，不出現(xiàn)大批死亡，嚴重時腸道發(fā)炎，肝胰腺萎縮、發(fā)軟，顏色變深，個別病蝦可排白便。發(fā)病對蝦生長速度緩慢或停滯，但個體差異大，50%～60%的對蝦體重停滯在4～5 g，直至養(yǎng)殖周期結(jié)束[5]。天津、浙江和山東等地的研究表明：同樣大小的凡納濱對蝦，EHP陽性群的平均體重比陰性群低30%；EHP陽性群中的凡納濱對蝦體長和體重變異系數(shù)分別是陰性群的（2.39±0.93）和（2.05±0.86）倍，表現(xiàn)為陽性群個體大小不均勻；EHP陽性群體重偏差率是陰性群的2.34～3.45倍；體長相同時，EHP陽性蝦的體重波動變大[13]。2014—2015年劉珍等[10]對江蘇、海南、山東等地的凡納濱對蝦進行檢測發(fā)現(xiàn)：EHP的載量指數(shù)與對蝦生長速率呈負相關(guān)；肝胰腺中的EHP載量在103copies/（ng HpDNA）數(shù)量級或EHP載量指數(shù)在3以上時，對蝦生長明顯變慢，代表了較高的風(fēng)險水平。

剖檢浙江省感染EHP凡納濱對蝦的鰓絲和肌肉組織，未見明顯病理變化，但發(fā)現(xiàn)肝胰腺組織病變嚴重，肝胰腺腔體變小或消失，細胞腫大，膜結(jié)構(gòu)模糊；肝胰腺上皮細胞腫大，界線模糊，細胞核壞死、消失；肝胰腺上皮細胞出現(xiàn)局灶性壞死或脫落；在病蝦肝胰腺中可觀察到EHP的孢子顆粒，大小為（1.3±0.2）μm×（0.8±0.2）μm；肝胰腺小管上皮細胞有嗜堿性的孢原質(zhì)和不同發(fā)育階段的孢子[5]。Kathy等[12]研究發(fā)現(xiàn)：EHP寄生在蝦腸細胞內(nèi)時，可引起腸壁發(fā)炎；印度尼西亞患白便綜合征（White feces syndrome，WFS）的凡納濱對蝦甲殼松弛，后腸呈白色；在對蝦白色糞便中檢測出密集的EHP孢子和數(shù)量較少的桿狀細菌；感染EHP的對蝦可伴有敗血性肝胰腺壞死（SHPN），中腸上皮細胞也可被EHP感染，因此EHP感染的組織類型較多。

試驗表明，感染EHP病蝦血淋巴中的總蛋白、白蛋白、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和堿性磷酸酶（ALP）等反映肝胰腺功能的生物化學(xué)參數(shù)數(shù)值均比健康蝦高得多[14]。肝胰腺病變致使肝胰腺功能受損。

4 EHP致病性

EHP感染往往伴隨著弧菌的繼發(fā)感染。EHP是對蝦急性肝胰腺壞死（AHPND）和敗血性肝胰腺壞死（SHPN）的一個危險因素。AHPND又稱早期死亡癥（EMS），其病原是一種特異的常見革蘭氏陰性菌——嗜鹽的副溶血性弧菌；SHPN病原為革蘭氏陰性，是專性細胞內(nèi)寄生的肝胰腺壞死性細菌，分散存在于感染的肝胰腺細胞質(zhì)內(nèi)。兩者均表現(xiàn)為肝胰腺壞死和高死亡率。EHP感染增強了對蝦AHPND、SHPN感染的敏感性，加重了肝胰腺細胞的壞死和脫落，提高了對蝦急性肝胰腺壞死（AHPND）和敗血性肝胰腺壞死（SHPN）的死亡率[15]。

EHP感染可導(dǎo)致蝦免疫力降低，繼而由水體中的條件致病菌引起繼發(fā)感染，出現(xiàn)腸炎、組織壞死、紅體等病癥。Biju等[2]從2014年3月至2015年4月在印度坦米爾泰、安德拉邦和奧里薩邦采集生長緩慢、低死亡率的235個池塘的對蝦樣品進行EHP檢測，發(fā)現(xiàn)斑節(jié)對蝦和凡納濱對蝦有高發(fā)病率，并伴有細菌感染。據(jù)泰國學(xué)者報道，泰國養(yǎng)殖凡納濱對蝦感染EHP時，雖然表現(xiàn)為WFS，但WFS與EHP感染沒有直接的因果關(guān)系[11]。

除EHP外，傳染性皮下和造血組織壞死病毒（Infections hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV）也是導(dǎo)致養(yǎng)殖對蝦生長緩慢的主要病原。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）在《水生動物衛(wèi)生法典》中，將該病定為須向其申報的甲殼類疾病之一。IHHNV感染凡納濱對蝦、斑節(jié)對蝦、細角濱對蝦后，引起病蝦生長遲緩，出現(xiàn)畸形，呈現(xiàn)出慢性感染癥狀，即慢性矮小殘缺綜合癥（Runtdeformity syndrome，RDS）。病蝦觸角、額劍、頭胸部及腹部甲殼等位置均出現(xiàn)不同程度病變；患病幼蝦表現(xiàn)為額劍和觸角彎曲、變形，甲殼粗糙無光澤或殘缺等病變[16]。因此，應(yīng)及時對養(yǎng)殖對蝦進行檢驗檢疫，盡快確定病原，從而進行有針對性的病害防控。

目前，白斑病毒（WSSV）對中國對蝦有很強的致病力。受感染的蝦常發(fā)生全身性病變，使蝦體更易于遭受其他病原體的侵害。中國對蝦感染W(wǎng)SSV后，可使仔蝦的微孢子蟲敏感性增加，使對蝦微孢子蟲感染率達90%以上[17]。如果多種養(yǎng)殖對蝦病害并發(fā)，危害將更大，應(yīng)引起養(yǎng)殖單位的警惕。

5 檢測方法

EHP比一般的微孢子蟲小，且不形成肉眼可見的胞囊；感染EHP的對蝦不表現(xiàn)特征性臨床癥狀。因此，需要在實驗室采用組織學(xué)或分子生物學(xué)方法確診EHP。

5.1 組織學(xué)方法

組織學(xué)方法是通過組織切片，HE染色，顯微觀察，揭示疾病引起的組織病理變化及器官損傷機制的方法，可診斷疾病的發(fā)生和發(fā)展過程，為病原的致病機制研究及有效防治提供理論依據(jù)。Tourtip等[1]根據(jù)微孢子蟲屬的超微結(jié)構(gòu)特征，胞原質(zhì)在細胞質(zhì)中的位置，SSU rRNA序列與微孢子蟲屬基因組（GenBank FJ496356）比對同源性（84%），首次分離出EHP。但組織學(xué)方法檢驗耗時長，操作繁瑣，當(dāng)病原含量低或處于潛伏期時，容易漏診或誤診，因此需結(jié)合分子生物學(xué)方法做出明確診斷。

5.2 分子生物學(xué)方法

目前，國內(nèi)外已有多種分子生物學(xué)方法用于檢測EHP。

5.2.1 原位雜交技術(shù)（In situ hybridization，ISH） 利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基序列，將有放射性或非放射性外源核酸（即探針）與組織、細胞或染色體上待測DNA或RNA互補配對，結(jié)合成專一的核酸雜交分子，然后經(jīng)檢測手段將待測核酸在組織、細胞或染色體上的位置顯示出來[5]。Tang等[18]采用原位雜交方法，特異性檢出對蝦組織、糞便和養(yǎng)殖水體中的EHP。雷燕等[20]根據(jù)GenBank中對蝦腸道上皮細胞的EHP基因保守序列，設(shè)計合成一對特異性引物，優(yōu)化PCR擴增條件，建立了EHP PCR方法。該法僅對EHP的基因組片段進行特異性PCR擴增，得到300 bp特異性擴增條帶，最低可檢測出約100 fg的EHP基因組DNA，可用于EHP感染初期或處于潛伏期幼蝦、親蝦，以及池塘底泥、水質(zhì)的檢測。

5.2.2 套式PCR（nested PCR） 通過兩輪PCR反應(yīng)，來增強檢測的特異性和敏感性。Amornrat等[11]利用套式PCR檢測方法，開展了EHP診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查。Suebsing等[20]應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）結(jié)合熒光納米金（AuNP）探針標(biāo)記的方法檢測EHP。該方法具有儀器設(shè)備要求低、結(jié)果判定簡單等優(yōu)點。它（0.02 fg總DNA）比傳統(tǒng)的套式PCR（0.2 fg總DNA）更敏感，適用于現(xiàn)場小型實驗室對親蝦、蝦苗的篩選和對蝦飼養(yǎng)期間的EHP監(jiān)測。

5.2.3 TaqMan實時熒光定量PCR方法 通過對DNA模板的定量，來實現(xiàn)對病原的檢測，對分析微孢子蟲載量和開展病原防控研究具有重要意義。駱云慧等[21]發(fā)現(xiàn)該方法對EHP標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的檢測靈敏度為5.20×102copies/μL，比常規(guī)PCR高10倍；從樣品核酸提取到檢驗完成，整個檢測反應(yīng)只需2 h，大大提高了EHP檢測效率，可滿足高通量檢測。劉珍等[10]對實時熒光定量PCR反應(yīng)中的引物濃度、探針濃度、退火溫度和反應(yīng)循環(huán)數(shù)等條件進行優(yōu)化，建立了EHP的SYBR Green I實時定量PCR檢測方法，檢測靈敏度下限為8.3×101copies/μL。該方法靈敏度高、成本低、操作簡單，適用于親蝦、苗種的快速檢測。篩選簡單易行、靈敏準(zhǔn)確的EHP檢測方法可為EHP早期預(yù)防控制和對蝦無特定病原（SPF）種群的選育提供參考依據(jù)。

6 防控措施

在對蝦養(yǎng)殖過程中，養(yǎng)殖水體、養(yǎng)殖工具，以及飼喂鮮活餌料等環(huán)境因素的嚴格把關(guān)，對控制對蝦EHP感染極為重要。陳祿芝[4]在未經(jīng)處理的海水樣品中檢測到EHP，而在經(jīng)過砂濾、臭氧消毒、精密過濾、紫外消毒等一系列處理過的水體中未檢測出EHP，可見消毒處理可以預(yù)防EHP感染和傳播。

對蝦EHP的控制需要依靠預(yù)防手段，主要包括：（1）加強苗種檢疫，選擇不帶病原的苗種。養(yǎng)殖戶在購苗時應(yīng)主動抽樣，委托具有資質(zhì)的檢測機構(gòu)檢驗，采購檢驗合格的苗種。（2）對于曾經(jīng)發(fā)生過對蝦生長緩慢的養(yǎng)殖池塘，應(yīng)采集有代表性的底泥進行檢測，對于EHP陽性的底質(zhì)必須進行嚴格的清塘滅孢。（3）車間水泥池應(yīng)徹底消毒，清洗干凈，晾干。（4）合理設(shè)置進排水系統(tǒng)。對于浮水井或外海水，需經(jīng)砂濾、蓄水池沉淀、曝氣、消毒等處理后方可使用；池塘排換的養(yǎng)殖尾水，需經(jīng)無害化處理后再排放，防止病原在不同養(yǎng)殖池塘或養(yǎng)殖場間傳播。

近年來，EHP的流行和傳播對我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展造成了嚴重影響，已成為導(dǎo)致對蝦生長緩慢的主要病原。盡快建立病害生物防控關(guān)鍵技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，加強對蝦養(yǎng)殖環(huán)境保護，繁育SPF對蝦苗種，改進EHP檢測技術(shù)，實時監(jiān)控疫情，可有效保障對蝦養(yǎng)殖的健康發(fā)展。

[1] TOURTIP S，WONGTRIPOP S，STENTIFORD G D，et al.Enterocytozoon hepatopenaei sp. nov.（Microsporida：Enterocytozoonidae），a parasite of the black tiger shrimp Penaeus monodon（Decapoda：Penaeidae）：Fine structure and phylogenetic relationships[J]. Journal of invertebrate pathology，2009，102（1）：21-29.

[2] BIJU N，SATHIYARAJ G，RAJ M，et al. High prevalence of Enterocytozoon hepatopenaei in shrimps Penaeus monodon and Litopenaeus vannamei sampled from slow growth ponds in India[J]. Diseases of aquatic organisms，2016，120（3）：22-30.

[3] 王博雅，王力，劉美如，等. 凡納濱對蝦3種主要病毒和蝦肝腸胞蟲在遼寧地區(qū)的流行情況分析[J]. 大連海洋大學(xué)學(xué)報，2017，32（2）：150-154.

[4] 陳祿芝. 粵西地區(qū)凡納濱對蝦蝦肝腸胞蟲、傳染性皮下和造血組織壞死病毒感染情況的初步調(diào)查[J]. 漁業(yè)研究，2016，38（4）：273-280.

[5] 施慧，許文軍，謝建軍，等. 舟山地區(qū)大棚凡納濱對蝦生長緩慢病因的調(diào)查分析[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué)，2017，24（2）：387-394.

[6] 姬全. 微孢子蟲誘發(fā)蝦蟹大批死亡[N]. 中國漁業(yè)報，2013-12-16（B02）.

[7] HAN J E，TANG K F，PANTOJA C R，et al. Detection of a new microsporidium Perezia sp. in shrimps Penaeus monodon and P. indicus by histopathology，in situ hybridization and PCR[J]. Diseases of aquatic organisms，2016，120（2）：165-171.

[8] 王維娜，王安利，陳麗，等. 斑節(jié)對蝦體內(nèi)微孢子蟲的超微結(jié)構(gòu)[J]. 動物學(xué)報，2001，47：78-81.

[9] 何玉英，李健，劉萍，等. 原位雜交技術(shù)及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J]. 漁業(yè)科學(xué)進展，2005，26（1）：74-79.

[10] 劉珍，張慶利，萬曉媛，等. 蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei）實時熒光定量PCR檢測方法的建立及對蝦樣品的檢測[J]. 漁業(yè)科學(xué)進展，2016，37（2）：119-126.

[11] AMORNRAT T，JIRAPORN S，SAISUNEE C，et al.The microsporidian Enterocytozoon hepatopenaei is not the cause of white feces syndrome in whiteleg shrimp Penaeus（Litopenaeus）vannamei[J]. BMC veterinary research，2013，9（1）：1-10.

[12] KATHY F J，JEE E H，LUIS F A，et al. Dense populations of the microsporidian Enterocytozoon hepatopenaei（EHP）in feces of Penaeus vannamei exhibiting white feces syndrome and pathways of their transmission to healthy shrimp[J]. Journal of invertebrate pathology，2016，140（10）：1-7.

[13] 劉雅梅，邱亮，程東遠，等. 檢出蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei）的凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）群體的體長和體重關(guān)系[J].漁業(yè)科學(xué)進展，2017，38（4）：96-103.

[14] SANTHOSHKUMAR S，SIVAKUMAR S，VIMAL S，et al. Biochemical changes and tissue distribution of Enterocytozoon hepatopenaei（EHP）in naturally and experimentally EHP-infected whiteleg shrimp，Litopenaeus vannamei（Boone，1931），in India[J].Journal of fish diseases，2017，40（4）：529-539.

[15] ARANGUREN F L，HAN J E，KATHY F J.Enterocytozoon hepatopenaei（EHP）is a risk factor for acute hepatopancreatic necrosis disease（AHPND）and septic hepatopancreatic necrosis（SHPN）in the Pacific white shrimp Penaeus vannamei[J]. Aquaculture，2017，471（3）：37-42.

[16] 白麗蓉，趙志英. 對蝦傳染性皮下與造血組織壞死病毒（IHHNV）的研究進展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2012，28（14）：114-119.

[17] 李鳳超. 商品對蝦中病原體的檢出及其致病力的研究[D]. 石家莊：河北大學(xué)，2000.

[18] TANG K F，PANTOJA C R，REDMAN R M，et al.Development of in situ hybridization and PCR assays for the detection of Enterocytozoon hepatopenaei（EHP），a microsporidian parasite infecting penaeid shrimp[J].Journal of invertebrate pathology，2015，130（9）：37-41.

[19] 雷燕，肖洋，張會軍，等. 凡納濱對蝦腸道上皮細胞微孢子蟲PCR檢測方法的建立與應(yīng)用[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2016，36（4）：50-54.

[20] SUEBSING R，PROMBUN P，SRISALA J，et al.Loop-mediated isothermal amplification combined with colorimetric nanogold for detection of the microsporidian Enterocytozoon hepatopenaei in penaeid shrimp[J].Journal of applied microbiology，2013，114（5）：254-1263.

[21] 駱云慧，石堅，方磊，等. 蝦肝腸胞蟲TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué)，2016，46（7）：847-852.