陶依然，劉婷婷，孫芳玲，艾厚喜，郭德玉，王 文

(首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院實驗動物室，北京 100053)

美國國立衛(wèi)生研究院(national institutes of health，NIH)最初認為組織型纖溶酶原激活劑(tissue type plasminogen activator, tPA)治療急性腦梗死的溶栓治療時間窗應在3 h內。2008年歐洲急性卒中協(xié)作研究Ⅲ(the european cooperative acute stroke study，ECASS-3)試驗研究結果顯示，tPA的有效治療時間窗可延長至4.5 h[1]。如果超過tPA的治療時間窗進行溶栓治療則會產(chǎn)生一系列的副作用，比如神經(jīng)毒性、水腫、出血性轉化等[2]。目前，出血反應是溶栓藥普遍存在的不良反應之一，嚴重的出血性轉化(hemorrhagic transformation，HT)可以導致腦卒中患者死亡率顯著增加[3]。HT是指由于腦梗死后缺血區(qū)重新恢復血流供應引起的繼發(fā)性出血[4]。HT的機制很復雜，目前尚不明確，主要認為與血腦屏障受損、細胞質基質降解、血管新生、高血壓、炎癥反應等有關。tPA治療引起的HT與血腦屏障(blood brain barrier，BBB)通透性增加及相關的微血管的破損有關[5]。血腦屏障的破壞是HT發(fā)生的基礎，血腦屏障包括毛細血管的基底膜和內皮細胞間的緊密連接。失去血流供應時，血腦屏障完整性受損?；|金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)是細胞內基質的主要降解酶，與血管壁細胞外基質的破壞和重建有密切的關系。腦缺血患者基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)和基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)表達量顯著增加，溶栓后MMP及其抑制劑比例嚴重失調，使得細胞質基質中層粘連蛋白laminin和組成BBB的緊密連接蛋白(ZO-1, occludin)等被降解，從而導致出血。缺血早期微血管內皮細胞上出現(xiàn)白細胞粘附受體，微血管完整性改變，微血管生成被激活，提示血管新生參與了HT的過程[6]。同時高血壓，炎癥因子等也與HT有關。尋找具有治療時間窗長、副作用小的腦卒中有效治療藥物對于腦卒中患者具有非常重要的意義。

由于擴大tPA治療時間窗引起的HT與血腦屏障通透性增加及相關的微血管破損有關，所以可以通過藥物靶向性阻止血腦屏障破壞和促進血管新生來減輕HT。本文主要結合HT的相關機制，探討在臨床前研究中可減輕超過tPA治療時間窗(中風發(fā)作后4.5 h)而帶來不良反應的藥物。其中包括保護血腦屏障的藥物(例如，米諾環(huán)素，西洛他唑，法舒地爾，坎地沙坦和內酯)和促血管新生的藥物(如香豆素衍生物IMM-H004和粒細胞集落刺激因子)等。

1 血腦屏障保護劑

1.1 米諾環(huán)素

米諾環(huán)素是一種四環(huán)素衍生物，臨床用于治療痤瘡。研究表明米諾環(huán)素是一個很好的MMP抑制劑[7]，具有神經(jīng)保護作用。米諾環(huán)素(3 mg/kg，靜脈注射，卒中后4 h)和tPA(10 mg/kg，靜脈注射，卒中后6 h)聯(lián)合使用能減少梗死體積，并在中風后24 h后改善腦出血情況[8]。米諾環(huán)素與tPA聯(lián)合使用不僅可以擴大時間窗還能降低神經(jīng)功能評分，降低死亡率[9]。米諾環(huán)素的神經(jīng)保護機制尚不明確，可能與其抗炎、抗氧化和抗凋亡作用有關[10]。米諾環(huán)素通過抑制缺氧誘導因子HIF-1α介導的細胞反應，保護血腦屏障[11]，減少小膠質細胞活化，抑制基質金屬蛋白酶的表達，減少神經(jīng)元的凋亡[12]。

1.2 西洛他唑

西洛他唑是FDA批準治療間歇性跛行的藥物[13]。在小鼠大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型中[14]，再灌注后6 h給予tPA(10 mg/kg，靜脈注射)和西洛他唑(10 mg/kg，靜脈注射)聯(lián)合治療能減輕HT，將時間窗擴大到18 h，連續(xù)7 d給藥能減輕腦水腫，降低發(fā)病率和死亡率，提高神經(jīng)功能。此外，西洛他唑能降低tPA治療延遲引起的MMP-9活性上調，抑制微血管內皮細胞之間的緊密連接蛋白claudin-5的減少[15]，保護血腦屏障不被破壞來減少HT的風險。在體外試驗中，西洛他唑可以通過影響cAMP去阻止tPA引起的內皮細胞和周細胞損傷。

1.3 GM6001

GM6001是一種廣譜的MMP蛋白抑制劑，能夠與MMPs的活性位點結合阻止金屬基質酶前體向金屬基質酶轉化[16]。在大鼠MCAO造模后6 h給予GM6001(100 mg/kg，腹腔注射)和tPA(10 mg/kg，靜脈注射)聯(lián)合治療，可降低tPA引起的腦血紅蛋白含量升高，并降低HT[17]。免疫印跡結果顯示再灌注后42 h聯(lián)合治療能減少MMP-9含量，并且降解封閉蛋白occludin和緊密連接蛋白ZO-1，但是對緊密連接蛋白claudin-5表達無影響[17]。單獨用GM6001治療也能明顯提高缺血再灌注大鼠的存活率并改善大鼠神經(jīng)功能。體外實驗結果顯示，GM6001能阻止tPA引起的內皮細胞減少和跨內皮電阻損壞。該藥物的其他潛在機制有待深入研究，如對腫瘤壞死因子TNF-α和腫瘤壞死因子轉換酶表達的影響等[17-18]。

1.4 法舒地爾

法舒地爾是一個Rho激酶抑制劑，即細胞內鈣離子拮抗劑，在日本作為蛛網(wǎng)膜下腔出血后發(fā)生腦血管痙攣的治療藥物銷售[19]。與MCAO造模后6 h單獨使用tPA(10 mg/kg，靜脈注射)對大鼠進行治療相比，tPA聯(lián)合法舒地爾(3 mg/kg，腹腔注射)治療可以改善再灌注18 h后的HT。降低再灌注7 d后的大鼠的死亡率，改善神經(jīng)功能。體外研究結果表明，法舒地爾與tPA聯(lián)合治療可以通過降低MMP-9活性減輕人腦微血管內皮細胞損傷[20]。此外，乳酸脫氫酶相關實驗還表明，法舒地爾不僅能對抗tPA誘導的急性和亞急性腦損傷也能保護受損內皮細胞[20]。法舒地爾長期神經(jīng)血管保護作用和改善tPA誘導的HT確切分子機制和與tPA聯(lián)合應用時的最佳劑量還有待進一步研究[20]。

1.5 坎地沙坦

坎地沙坦是一種血管緊張素ⅡAT1受體拮抗劑，可以減少由缺血性腦卒中引起的損傷[21-22]。在腦缺血動物模型中，在卒中后3 h給予坎地沙坦(1 mg/kg)和卒中后6 h給予tPA(10 mg/kg，靜脈注射)聯(lián)合治療，能減少腦出血并改善神經(jīng)功能[23]。研究顯示，與對照組相比，聯(lián)合治療可以減輕tPA治療腦缺血大鼠后的引起的顱內出血，并且降低金屬基質蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3，MMP-3)含量，但對MMP-9無影響。此外，坎地沙坦和tPA聯(lián)合治療能降低核因子κB(nuclear factor kappaB，NF-κB)與腫瘤壞死因子 TNF-α的表達水平。坎地沙坦的治療還能增強內皮型一氧化氮合酶的活性，其對血管功能的調節(jié)至關重要的，最終起到卒中后的神經(jīng)保護作用[24]。

1.6 苔蘚蟲素

苔蘚蟲素是自海洋生物草苔蟲中提取的一種PKC活化劑，在中老年雌性大鼠MCAO造模后6 h給予治療能顯著降低缺血性腦損傷[25]。通過注入自體血栓制作雌性大鼠MCAO模型，造模后2 h給予苔蘚抑素(2.5 mg/kg，靜脈注射)能減少延遲tPA(5 mg/kg，靜脈注射)治療引起的腦腫脹、腦出血和24 h內的死亡率[26]。苔蘚蟲素也能減輕血腦屏障的破壞和出血性轉化，并下調MMP-9的表達，上調PKC?表達[26]。MMP-9調控蛋白激酶C的機制[27]可能在苔蘚蟲素減少延遲tPA引起的HT和血腦屏障破壞起到了有益的作用。

2 促血管新生藥物

因為血管破裂是腦出血的主要原因，血腦屏障的破壞是次要原因[28]。所以除保護血腦屏障的完整性外，促進新生血管也可能減弱延遲tPA引起的HT。新生的血管可為神經(jīng)的新生提供神經(jīng)營養(yǎng)因子，并為新生的神經(jīng)細胞遷移到缺血周邊區(qū)域提供依附的支架，是梗死周邊區(qū)域腦組織抗損傷和神經(jīng)元修復的結構基礎[28]。此外，研究表明血管新生發(fā)生在缺血區(qū)，有助于改善梗死、腦血流和神經(jīng)元功能的恢復[29]。

2.1 香豆素衍生物IMM-H004

香豆素類化合物是一類重要的具有多種生物活性的有機雜環(huán)化合物, 具有調節(jié)植物生長、抗菌抗病毒、抗凝血、松弛平滑肌、吸收紫外線和抗輻射等多種生物活性[30]。在卒中后6 h tPA(10 mg/kg，靜脈注射)與IMM-H004(6 mg/kg，靜脈注射)聯(lián)合治療能減少出血、大鼠腦梗死體積和腦水腫[31]。同樣有研究表明，在用線栓法制備的大鼠腦缺血模型中，聯(lián)合治療能減少tPA引起的HT和梗死體積[32]。腦缺血7 d后，IMM-H004能促進血管生成，改善血管內皮細胞的完整性，改善腦血流。體外實驗表明，IMM-H004可以增加ATP和PKA的水平，并且在HBMECs和PC12細胞中激活Akt和PI3K，通過調節(jié)cAMP/PKA和PI3K/Akt信號通路促進血管新生[31]。作者認為，IMM-H004能減少tPA治療引起的出血性轉化與促進血管新生有關[31]。

2.2 粒細胞集落刺激因子

粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)是能在體內外調節(jié)造血干細胞存活、增殖、分化以及成熟白細胞功能的一組糖蛋白生長因子[32]。有研究表明，在誘導大鼠腦卒中后，將時間窗擴大到6 h給予G-CSF(300 μg/kg，靜脈注射)與tPA(10 mg/kg，靜脈注射)聯(lián)合治療7 d與單獨使用tPA相比，能改善大鼠神經(jīng)功能和運動能力。此外使用G-SCF治療也降低了死亡率，減少延遲使用tPA引起的HT和血紅蛋白減少[33]。此外，能明顯增加缺血側大腦Ang-2、vWF、磷酸化eNOS、CD34+內皮細胞和VEGFR-2的含量，并且改善大鼠24 h后神經(jīng)系統(tǒng)功能。因此，G-CSF通過促進內皮干細胞血管新生和修復的機制來降低延遲tPA引起的HT從而提高卒中后的神經(jīng)功能[33]。值得注意的是，在臨床研究中發(fā)現(xiàn)生長因子如VEGF、Ang-1和G-CSF能增強動脈再通和提高tPA治療急性缺血性腦卒中患者的臨床預后[34]。以上這些研究結果表明，G-CSF可以減少延遲tPA治療引起的HT。目前，關于G-CSF療效評價僅局限于急性腦卒中，其對腦血管保護的長期療效還不清楚。G-CSF在腦卒中模型中的最佳劑量還在研究中[35]，并評價其聯(lián)合治療的效果，以期進一步提高該方法的臨床應用前景。

3 其他

目前，關于自由基與抗氧化劑[36]在延遲tPA治療時間窗中的作用也進行了研究。此外，促紅細胞生成素在急性腦缺血中也被證實能改善神經(jīng)功能。維生素C與十二氟戊烷乳劑(dodecafluoropentane emulsion，DDFPe)等也有較多研究，但這些研究僅證明了這些藥物干預措施能改善中風，關于其對HT的影響目前尚未確定。

3.1 維生素C

局灶性缺血腦損傷后谷胱甘肽和抗壞血酸水平降低，自由基形成增加，從而加重血腦屏障的破壞，補充維生素C可以來改善缺血性腦損傷后的預后[36]。研究證明，維生素C具有中和自由基，特別是在腦實質中保護內皮細胞功能和抗氧化的作用，能對抗延遲tPA引起的不良反應[37]。腦卒中后5 h，低劑量tPA(1 mg/kg)和維生素C(500 mg/kg)聯(lián)合治療組大鼠與單獨給予tPA組大鼠相比，卒中后48 h腦梗死體積和水腫明顯減少。同時，聯(lián)合治療也能減少延遲tPA引起的MMP-9水平增加和血腦屏障的損壞[37]。維生素C可能是通過中和自由基，來保護血腦屏障，從而減輕延遲tPA帶來的不良反應和發(fā)揮神經(jīng)保護作用的功效，表明其具有擴大tPA治療窗的輔助治療藥物的潛力。

3.2 DDFPe

DDFPe納米質粒是一種氧運輸?shù)鞍?，在腦缺血模型中可發(fā)揮腦保護作用。在新西蘭兔腦卒中栓塞模型中檢測DDFPe(0.3 mL/kg)能否延長tPA治療時間窗(0.9 mg/kg，卒中后9 h給予)[38]，結果顯示聯(lián)合治療能將tPA治療時間窗有效延長至9 h，并沒有增加出血轉化的風險。并且能改善在24 h后的神經(jīng)功能評分和腦梗死體積。但是其研究者只研究了9 h這個時間點，關于其他時間點的療效和其他動物模型還有待進一步研究[38]。其作用機制可能是在在血細胞不足的時候改善了氧氣的運輸，具體機制還有待研究。

3.3 促紅細胞生成素

促紅細胞生成素(erythropoietin, EPO)是由腎臟和肝臟分泌的一種激素樣物質，能夠促進紅細胞生成，對心臟、神經(jīng)等組織器官具有抗凋亡，促進血管再生等作用[39]。有研究表明重組人類促紅細胞生成素對急性腦缺血有很好的治療效果[40]。局部血管內注射tPA聯(lián)合低劑量截短寡糖鏈的Neuro-EPO可以減少大鼠腦缺血再灌注24 h的病死率，改善神經(jīng)功能，同時減少腦水腫和腦出血。而且Neuro-EPO沒有EPO的紅細胞生成功能，從而避免了血細胞比容增加導致的血液動力學改變[41]。目前認為大腦中動脈低劑量注射促紅細胞生成素可能是通過激活AKT和ERK通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用，具體機制還有待進一步研究。

4 總結與展望

本文探討了可以延長tPA溶栓治療時間窗的藥物，以及能夠降低晚期溶栓治療引起的出血轉化風險的藥物。延長時間窗進行溶栓治療不僅可以通過藥物和干細胞來實現(xiàn)，也可以通過其他非藥物途徑。通過腦成像技術可以確定出血轉化風險高的患者和臨床預后不良的患者，預測溶栓后的出血風險以改善tPA的治療時間窗和治療方法，提高安全性[42]。以前的試驗還表明，血管內手術，例如動脈取栓，能改善卒中患者靜脈溶栓。近期，最新的一項研究表明，灌注成像可篩選出頸內動脈顱內段或大腦中動脈近段閉塞引起的急性缺血性卒中患者。這部分患者在超出tPA溶栓時間窗(發(fā)病6～24 h)的情況下仍可通過血管內血栓切除術清除血栓改善臨床結局[43]。取栓加溶栓治療相比溶栓已被證明可以改善功能預后，降低患者的死亡率[44-45]。今后有可能在成像技術的指導下把握好治療時間窗，根據(jù)不同的個體情況，聯(lián)合應用溶栓和神經(jīng)保護療法，以便能安全、有效的改善缺血性腦卒中患者的功能恢復。