陳 濤，奚菊群，劉忠軍，王靜成，馮新民，張 亮,*，楊建東*，黃澤楠，畢松超

(1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院，長沙 410013； 2.揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225001；3.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，江蘇 揚(yáng)州 225001； 4.北京大學(xué)第三醫(yī)院骨科，北京 100191)

腰痛已成為45歲以上人群功能受限的最主要原因，80%的成年人一生中受到不同程度的腰痛影響[1]。在美國，每年用于治療腰痛的花費高達(dá)1000億美元[2]。盡管腰痛的確切致病因素仍不明確，但研究發(fā)現(xiàn)至少40%的腰痛與椎間盤退變密切相關(guān)[3]。目前無論保守治療或手術(shù)治療均只能改善癥狀，無法實現(xiàn)改善椎間盤退變的本質(zhì)。近年來，采用細(xì)胞生物學(xué)手段，通過促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成或抑制其降解，以期從根本上延緩或逆轉(zhuǎn)椎間盤退變[4]。研究發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)可以影響椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)的合成，上調(diào)BMP-2表達(dá)可以促進(jìn)正常髓核細(xì)胞甚至是退變髓核細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)II型膠原及蛋白多糖的表達(dá)，從而重建正常椎間盤的功能[5-6]?？紤]到在脊柱融合手術(shù)中直接使用BMP的多種并發(fā)癥[7]，因此直接將BMP用于椎間盤退變的治療存在一定風(fēng)險。

他汀類藥物屬羥甲基戊二酰輔酶A(HMG -COA)還原酶抑制劑，臨床上廣泛用于高脂血癥的治療。研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀可通過甲羥戊酸途徑上調(diào)髓核細(xì)胞中骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)得表達(dá)，從而促進(jìn)II型膠原及蛋白多糖等細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)[8]。鄒立學(xué)等[9]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)小于0.4 μmol/L的較低濃度范圍內(nèi)辛伐他汀對細(xì)胞活力無明顯影響。進(jìn)一步將辛伐他汀植入大鼠退變椎間盤，治療2周后發(fā)現(xiàn)磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)上椎間盤信號好轉(zhuǎn)，髓核細(xì)胞外基質(zhì)合成增加，II型膠原及BMP-2 的mRNA表達(dá)增加[10]。然而辛伐他汀難溶于水，口服生物利用度低等缺點限制了其臨床應(yīng)用。聚合物緩釋微球作為一種新型藥物載體，由天然或合成的高分子物質(zhì)聚合而成，具有靶向給藥、提高藥物穩(wěn)定性及控制藥物釋放等優(yōu)勢。聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)是一種常用的藥物緩釋系統(tǒng)，其負(fù)載的藥物已成功用于多種疾病動物模型的治療[11]。

因此，本研究通過在大鼠退變椎間盤內(nèi)注入辛伐他汀-PLGA緩釋微球，通過影像學(xué)、組織學(xué)及分子生物學(xué)等評估對于椎間盤退變的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性SD大鼠32只，3月齡，體重320～400 g，購自江蘇大學(xué)實驗動物中心[SCXK(蘇)2013-0011號]，動物飼養(yǎng)及取材于揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院動物實驗設(shè)施內(nèi)進(jìn)行[SYXK(蘇)2017-0044號]，并通過揚(yáng)州大學(xué)實驗動物福利倫理委員會的福利倫理審查。

1.2 主要試劑與儀器

辛伐他汀、PLGA(PLA: PGA=50:50，分子量=31000)、HEPES(美國Sigma公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；二氯甲烷、聚乙烯醇、100%乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司)；RT-PCR引物(上海吉凱生物)；紫外可見光光度計(U-3900 Hitachi)；掃描電鏡(S-4800II Hitachi)；X線(MX-20，美國Faxitron公司)；MRI(7.0T，Bruker Pharmascan公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 椎間盤退變動物模型的制備

采用本課題組既往的方法制備[12]，1%戊巴比妥納溶液，以0.4 mL/kg經(jīng)腹腔注射麻醉。達(dá)到麻醉效果后，用數(shù)字式鉬耗線攝像機(jī)拍攝大鼠尾椎正位片，定位Co6/7、Co7/8、Co8/9尾椎椎間隙(Co6/7、Co8/9作為穿刺組，Co7/8作為對照組)。大鼠俯臥位，消毒骶部及鼠尾，用21號注射針頭于背側(cè)中心經(jīng)皮垂直穿刺入椎間隙約5 mm后，注射針頭旋轉(zhuǎn)360度，并停留30 s。術(shù)后再次消毒，并密切觀察至麻醉蘇醒，放回籠中自由活動。

1.3.2 辛伐他汀PLGA緩釋微球制備

將PLGA與辛伐他汀按質(zhì)量比10∶3.3共同溶解于二氯甲烷中，形成均勻分散液；加入200 μL水，超聲混合；緩慢加入10 mL的5%聚乙烯醇水溶液中，超聲粉碎3 min，加入50 mL 0.3%聚乙烯醇水溶液中，攪拌過夜，除凈有機(jī)溶劑；冷凍干燥48 h，獲得辛伐他汀PLGA緩釋微球。

1.3.3 微球的包封率及載藥量測定

精確稱量5 mg 的微球，配成100 mL的乙醇溶液，以乙醇為空白對照，在238 nm處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算微球中辛伐他汀含量。根據(jù)以下公式計算包封率和載藥量：包封率=微球中的辛伐他汀總量/微球總量×100%，載藥量=實際載藥量/理論載藥量×100%。

1.3.4 緩釋微球形態(tài)觀察及微球的體外釋放

通過掃描電鏡觀察微球形狀、大小和表面形態(tài)。取干燥的辛伐他汀PLGA緩釋微球及空白微球粉末各0.005 g，用20 mL磷酸鹽緩沖液 (pH=7.4)分散，37℃水??；分別于不同時間間隔取3 mL上清液，用新鮮磷酸鹽緩沖液3 mL補(bǔ)足原液；紫外可見光光度計檢測各試樣于238 nm處的吸收值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出各試液中辛伐他汀濃度，計算累積釋放量，確定載藥微球的辛伐他汀釋放曲線。

1.3.5 實驗分組及處理

在實驗動物造模完成2周后將模型動物尾椎Co6/7節(jié)段作為對照組，Co8/9作為實驗組，每組16只。對照組注入等量生理鹽水，實驗組注入辛伐他汀PLGA緩釋微球溶液2 μL，注射時采用生理鹽水將微球濃度調(diào)整到5 mg/mL，為防止PLGA微球溶液的弱酸性特征，故釆用DMEM培養(yǎng)基、HEPES及NaHCO3將溶液pH值調(diào)整到中性。使用31G針頭的微量注射器，手術(shù)方法同模型建立，注射后，在局部停留30 s，保證注射液不會溢出，同時每次注射后都更換新的無菌微量注射器。

1.3.6 X線觀察椎間隙高度

在注射前、注射后2周及4周時進(jìn)行大鼠尾椎X線檢查，掃描參數(shù)為50 kV，100 mA，50 ms。根據(jù)X線計算椎間隙高度指數(shù)(disc height index, DHI)用以表示椎間隙高度[7]，相對椎間隙高度指數(shù)(DHI%)=(穿刺后DHI/穿刺前DHI)×100%。

1.3.7 核磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)檢查

在注射前、注射術(shù)后2周及4周時采用進(jìn)行MRI檢查，掃描參數(shù)如下：序列重復(fù)時間/回波時間為3000/30 ms，層厚0.5 mm，間隔0 mm。根據(jù)矢狀位T2WI像Pfirrmann進(jìn)行分級評分[13]。

1.3.8 組織學(xué)檢查

MRI掃描后采用注射戊巴比妥過量麻醉法處死，切取對照組及實驗組椎間盤(包含上下終板)，4%多聚甲醛固定3 d，脫鈣處理，石蠟包埋后切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，并按照Keorochana等[14]方法評分；甲苯胺藍(lán)染色按照Norcross等[15]方法進(jìn)行評分。

1.3.9 RT-qPCR檢測

處死后的大鼠，切取對照組及實驗組椎間盤，將髓核剪成1 mm3左右小塊并研磨，采用Trizol法提取總RNA，按照qPCR試劑盒操作說明書進(jìn)行BMP-2、低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)、II型膠原及蛋白多糖mRNA表達(dá)檢測，同時將甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參照。RT-qPCR反應(yīng)步驟：95℃ 20 s，95℃ 5 s，60℃ 20 s，重復(fù)40個循環(huán)，每次循環(huán)讀取Ct(cycle threshold)值，重復(fù)3組。所得各組Ct值用2-△△Ct表示計算各靶基因相對表達(dá)水平。各引物序列信息見(表1)。

表1 引物序列Table.1 Primer sequences

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 辛伐他汀PLGA緩釋微球的表征

圖1a可見辛伐他汀PLGA緩釋微球呈球形、形狀規(guī)則，分散性好且無聚集現(xiàn)象，表面光滑，分布均勻，平均粒徑為(1.52 ± 0.54)μm。微球載藥率為(23.3±1.3)%，包封率為(90.4±2.6)%。圖1b所示，微球包裹的辛伐他汀在最初24 h內(nèi)存在藥物突釋現(xiàn)象，約占藥物總量的45%，而在隨后144 h內(nèi)持續(xù)緩慢釋放辛伐他汀且釋放濃度較穩(wěn)定，累計釋放超過81.2%。由此可見，本實驗制備的辛伐他汀PLGA緩釋微球能夠滿足緩釋要求。

2.2 相對椎間隙指數(shù)

圖2所示，對照組椎間隙高度進(jìn)一步降低，與治療前相對椎間隙指數(shù)比較，2周及4周時差異均有顯著性(P< 0.05)。實驗組治療后椎間隙高度降低不明顯，與治療前相對椎間隙指數(shù)比較，差異無顯著性(P> 0.05)；但4周時與對照組比較，差異有顯著性(P< 0.05)。

2.3 MRI評分

圖3所示，對照組椎間盤退變程度進(jìn)一步加重，與治療前MRI評分比較，2周及4周時差異均有顯著性(P< 0.05)。實驗組治療后椎間盤退變程度有所減輕，與治療前MRI評分比較，4周時差異有顯著性(P< 0.05)；與對照組同時間點比較，差異均有顯著性(P< 0.05)。

注：(a)辛伐他汀PLGA緩釋微球的掃描電鏡圖片；(b)微球藥物釋放曲線。圖1 辛伐他汀PLGA緩釋微球形態(tài)及藥物釋放曲線Note.(a)SEM image of simvastatin-loaded PLGA microspheres.(b)Cumulative drug release rate of microspheres.Figure.1 SEM image of simvastatin-loaded PLGA microspheres and cumulative drug release rate

注：與同組注射前比較，*P< 0.05；與對照組比較，#P< 0.05。圖2 對照組及實驗組椎間隙高度及相對椎間隙高度指數(shù)Note.Compared with the pre-injection,*P< 0.05.Compared with the control group,#P< 0.05.Figure.2 The disc height and DHI% of the control group and experimental group

2.4 蘇木素-伊紅染色結(jié)果

圖4所示，對照組HE染色評分逐漸增加，4周時與治療前比較差異有顯著性(P< 0.05)。實驗組治療后HE染色評分逐漸降低，與治療前及對照組相同時間點比較，差異均有顯著性(P< 0.05)。

2.5 甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果

圖5所示，對照組甲苯胺藍(lán)染色評分逐漸降低，4周時與治療前比較差異有顯著性(P< 0.05)。實驗組治療后甲苯胺藍(lán)染色評分逐漸增加，4周時與治療前比較差異有顯著性(P< 0.05)；與對照組同時間點比較，差異均有顯著性(P< 0.05)。

2.6 RT-qPCR檢測結(jié)果

與對照組比較，實驗組中BMP-2、HIF-1α、II型膠原及蛋白多糖表達(dá)明顯增加，差異有顯著性(P< 0.05)，但2周與4周時比較，差異無顯著性(P> 0.05)。(圖6)

注：與同組注射前比較，*P< 0.05；與對照組比較，#P< 0.05。圖3 對照組及實驗組MRI影像及評分Note.Compared with the pre-injection,*P< 0.05.Compared with the control group,#P< 0.05.Figure.3 MRI images and scores of the control group and experimental group

注：與同組注射前比較，*P< 0.05；與對照組比較，#P< 0.05。圖4 對照組及實驗組HE染色圖像及HE染色評分Note.Compared with the pre-injection,*P< 0.05.Compared with the control group,#P< 0.05.Figure.4 The HE staining images and scores of the control group and experimental group

注：與同組注射前比較，*P< 0.05；與對照組比較，#P< 0.05。圖5 對照組及實驗組甲苯胺藍(lán)染色圖像及甲苯胺藍(lán)染色評分Note.Compared with the pre-injection,*P< 0.05.Compared with the control group,#P< 0.05.Figure.5 The toluidine blue staining images and scores of the control group and experimental group

注：與同時間點對照組比較，*P< 0.05。圖6 對照組及實驗組的BMP-2、HIF-1α、Collagen II 和Aggrecan基因mRNA相對表達(dá)量比較Note.Compared with the control group,*P< 0.05.Figure.6 BMP-2, HIF-1α, collagen II, and aggrecan mRNA expression of the control group and experimental group

3 討論

研究表明，辛伐他汀可促進(jìn)Π型膠原及聚集蛋白聚糖等椎間盤細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的mRNA表達(dá)[8-9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)合適濃度的辛伐他汀可以促進(jìn)椎間盤髓核內(nèi)源性干細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)分泌，同時有助于誘導(dǎo)髓核干細(xì)胞向髓核細(xì)胞分化[16-17]。因此本研究通過建立椎間盤退變動物模型，研究椎間盤內(nèi)局部注射PLGA辛伐他汀緩釋微球的治療效果，以期延緩甚至逆轉(zhuǎn)椎間盤退變進(jìn)程。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在椎間盤退變2周后注射PLGA辛伐他汀緩釋微球，MRI上椎間盤退變評分明顯改善，并且在注射后4 周時達(dá)到最佳；組織學(xué)評分在治療后逐漸好轉(zhuǎn)，且細(xì)胞外基質(zhì)成分II型膠原及蛋白多糖mRNA表達(dá)逐漸增加，與文獻(xiàn)報道類似[10]。說明辛伐他汀PLGA緩釋微球可以有效改善椎間盤退變進(jìn)程。

高分子材料PLGA因具有良好的生物降解性、相容性、無刺激性、無免疫原性及無毒等特點，已被廣泛用于藥物緩釋和被動靶向給藥系統(tǒng)，且已用于臨床[11]。因此本研究選擇PLGA作為緩釋材料負(fù)載辛伐他汀，以提高辛伐他汀使用效率。從PLGA辛伐他汀緩釋微球的體外釋放曲線可看出，緩釋微球包裹的辛伐他汀可以達(dá)到較穩(wěn)定的緩釋效果，保證椎間盤內(nèi)穩(wěn)定的藥物濃度，為退變椎間盤提供可靠的再生環(huán)境。

對于辛伐他汀促進(jìn)椎間盤退變修復(fù)的機(jī)制，目前研究認(rèn)為辛伐他汀主要通過上調(diào)髓核細(xì)胞中BMP-2表達(dá)，從而促進(jìn)髓核細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)[5,9-10]。而Hu等[18]研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物可使單層培養(yǎng)的已去分化的髓核細(xì)胞表型發(fā)生逆轉(zhuǎn)，從而促進(jìn)II型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)。本課題組前期研究還發(fā)現(xiàn)適當(dāng)濃度的辛伐他汀可在體外促進(jìn)內(nèi)源性髓核干細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原及蛋白多糖的分泌，其機(jī)制可能與HIF-1α信號通路有關(guān)[16, 19]。Liu等[20]研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α可以通過NOTCH1信號途徑調(diào)節(jié)椎間盤髓核細(xì)胞中蛋白多糖及II型膠原表達(dá)，從而影響椎間盤退變進(jìn)程。於紹龍等[21]研究還發(fā)現(xiàn)，HIF-1α基因可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)染BMP-2基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化能力，說明一定程度上HIF-1α可以促進(jìn)BMP-2在目標(biāo)細(xì)胞中發(fā)揮應(yīng)有作用。結(jié)合本研究結(jié)果，注射辛伐他汀PLGA緩釋微球后椎間盤中HIF-1α及BMP-2表達(dá)均明顯增加，表明辛伐他汀可能通過HIF-1α及BMP-2途徑來促進(jìn)髓核細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)，以及促進(jìn)髓核組織中殘留的髓核干細(xì)胞增殖等途徑，來實現(xiàn)修復(fù)重建退變椎間盤的目的，但具體作用機(jī)制及信號通路仍需進(jìn)一步研究明確。

本研究仍存在一些不足，盡管細(xì)針穿刺纖維環(huán)制作的椎間盤退變動物模型在組織學(xué)與人類椎間盤退變進(jìn)程相似，但兩者生理病理過程是否完全相同仍不可知，且因種屬不同，因此應(yīng)用于臨床時應(yīng)慎重。另外，本研究未比較不同濃度梯度的辛伐他汀PLGA緩釋微球的療效，無法得到最佳藥物濃度。

綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)在局部注射辛伐他汀PLGA緩釋微球可以改善SD大鼠椎間盤退變程度，其機(jī)制可能與HIF-1α及BMP-2信號通路有關(guān)，這為辛伐他汀用于治療椎間盤退變性疾病提供了一定的理論依據(jù)。