王 敏，陳榮昌，季宇彬，韓 冰，葛一蒙，王 姍，孫桂波*，孫曉波*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所藥理毒理中心，北京 100193； 2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱 150076； 3.黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司，黑龍江 雞西 158400)

急性呼吸道感染是世界范圍內(nèi)兒童感染發(fā)病和死亡的重要原因之一[1-2]，造成急性呼吸道感染的病原體90% 約為病毒，細(xì)菌感染為病毒感染后繼發(fā)感染或直接感染約占10%。病毒感染主要包括流感病毒，呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)和腺病毒等[3-4]。細(xì)菌感染主要包括流感嗜血桿菌、肺炎球菌、葡萄球菌和大腸埃希菌等[5]。RSV和流感病毒被證明是導(dǎo)致急性上呼吸道感染的主要原因，RSV被報(bào)道為兒童下呼吸道感染的主要病原體，也是與細(xì)菌性病原體相結(jié)合最常見的病原體[6-9]。小兒熱速清糖漿具有清熱解毒，瀉火利咽等功效[10-11]。臨床研究表明小兒熱速清糖漿對(duì)于兒童上呼吸道感染具有確切療效[12]。但對(duì)急性下呼吸道感染及病菌感染是否有療效尚未有臨床及實(shí)驗(yàn)證明。本文據(jù)此對(duì)小兒熱速清糖漿的抗病毒及抗菌作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，為其治療下呼吸道感染提供實(shí)驗(yàn)支持，并為臨床治療急性呼吸道感染提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)ICR小鼠442只，3周齡，體重9～11 g，抗病毒實(shí)驗(yàn)小鼠134只，抗菌實(shí)驗(yàn)小鼠308只，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(吉)2013-0001]，在吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物教研室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[SYXK(吉)2013-0005]，福利倫理審查證號(hào)2015-11-10。

1.2 細(xì)胞、病毒及菌株

宮頸癌細(xì)胞(Helen Lane，Hela) 用于呼吸道合胞病毒的培養(yǎng)，犬腎細(xì)胞(MDCKcanine kidney cell，MDCK) 用于流感病毒培養(yǎng)，本實(shí)驗(yàn)室保存。甲型流感病毒FM1 購于武漢病毒研究所。呼吸道合胞病毒ATCC標(biāo)準(zhǔn)株(RSV，Long株) 由廣州呼吸病研究所饋贈(zèng)。臨床分離株：大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，表皮葡萄球菌，乙型溶血性鏈球菌，肺炎克雷伯菌；耐青霉素和青霉素敏感金黃色葡萄球菌，均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 主要試劑與儀器

小兒熱速清糖漿(批號(hào)：z19980095)，黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司；感冒止咳糖漿 (批號(hào)：20150101)，貴州拜特制藥有限公司；達(dá)菲(批號(hào)：SH0047)，瑞士巴塞爾豪夫邁·羅氏有限公司；青霉素V鉀片(批號(hào)：815004)，重慶科瑞制藥有限公司。

DMEM培養(yǎng)基(批號(hào)：8116489，美國Gibco)；胎牛血清(批號(hào)：1619279，美國Gibco)；胰蛋白酶(批號(hào)：20170912，北京索萊寶)；乙醚(批號(hào)：20160118，北京化工廠)；生理鹽水(批號(hào)：E17042911，山東華魯制藥)。

CKX41型倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS)；MQX 200型微孔板掃描酶標(biāo)儀(美國BioTek instrument)；Heraeus BB15型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 培養(yǎng)基

(1)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：培養(yǎng)大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌。

(2)4%瓊脂培養(yǎng)基：普通肉湯培養(yǎng)基加入4%瓊脂粉。培養(yǎng)銅綠假單胞菌。

(3)血瓊脂培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基加熱溶化，約55℃時(shí)注入羊全血，混均。培養(yǎng)乙型溶血性鏈球菌。

(4)MH肉湯、MH瓊脂培養(yǎng)基：藥物最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)的測(cè)定。

1.4.2 藥物對(duì)病毒致細(xì)胞病變作用的影響

FM1和RSV稀釋為10-1，10-2，10-3…10-9不同稀釋度，分別感染MDCK和Hela細(xì)胞，并設(shè)細(xì)胞對(duì)照，計(jì)算50% 細(xì)胞感染量(tissue culture infective dose，TCID50)。小兒熱速清糖漿、感冒止咳糖漿濃度設(shè)為1，達(dá)菲為1000 g/L用無血清培養(yǎng)基對(duì)藥物原液進(jìn)行2倍遞比稀釋9個(gè)濃度，設(shè)8個(gè)復(fù)孔，分別加于Hela和MDCK單層細(xì)胞上，并設(shè)細(xì)胞對(duì)照，96孔板培養(yǎng)72 h，每孔加噻唑藍(lán)(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)100 μL，孵育4 h每孔加二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)150 μL震蕩2 min酶標(biāo)儀570 nm檢測(cè)，計(jì)算最大無毒濃度(maximum non-toxic concentration，TC0)，50%細(xì)胞中毒濃度(median toxic concentration，TC50)。FM1和RSV以100TCID50[13-14]的量攻擊細(xì)胞，37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱吸附2 h，棄病毒液，加入各藥物最大無毒濃度和待測(cè)藥物最大無毒濃度2倍遞比稀釋兩個(gè)濃度每孔200 μL，設(shè)8個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)陽性對(duì)照藥物、細(xì)胞對(duì)照、病毒對(duì)照和空白對(duì)照組。培養(yǎng)5 d，觀察細(xì)胞病變作用(cytopathic effect，CPE)并記錄，計(jì)算藥物對(duì)FM1和RSV病毒的半數(shù)抑制濃度(the half maximal inhibitory concentration，IC50)，并計(jì)算治療指數(shù)(therapeutic index，TI=TC50/IC50)。

1.4.3 藥物對(duì)FM1流感病毒致小鼠肺炎的治療作用

小鼠50只，隨機(jī)平均分成5組，乙醚輕度麻醉滴鼻感染10-1，10-2～10-5不同稀釋度的流感病毒液0.1 mL，觀察14 d，計(jì)算病毒的半數(shù)致死量(median lethal dose，LD50)。小鼠84只隨機(jī)分為7組，每組12只，包括正常組、病毒模型組、達(dá)菲組0.0364 g/kg、感冒止咳糖漿組10 mL/kg和小兒熱速清糖漿高(40 mL/kg)、中(20 mL/kg)、低(10 mL/kg)劑量組。感染前1 d給藥，乙醚淺麻醉下滴鼻感染FM1 5LD50[15-17]一次，連續(xù)給藥7 d，病毒模型和正常對(duì)照組灌服等體積的生理鹽水。感染后第6天解剖，取肺稱重，計(jì)算肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率，取各組鼠肺分別修塊，經(jīng)梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片(厚度5 μmol/L)，蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)，光鏡下檢查。

肺指數(shù)=肺重/體重×100%

肺指數(shù)抑制率=(感染模型組平均肺指數(shù)-實(shí)驗(yàn)組平均肺指數(shù))/感染模型組平均肺指數(shù)×100%

1.4.4 藥物體外抑菌率測(cè)定

小兒熱速清糖漿和感冒止咳糖漿原液濃度設(shè)定為1，青霉素V鉀片MH肉湯稀釋，終濃度為64 mg/mL，MH肉湯將三種藥物進(jìn)行二倍遞比稀釋5個(gè)濃度，測(cè)定乙型溶血性鏈球菌MIC培養(yǎng)基中需加10%血清。將細(xì)菌接種于各自適用的瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24 h后，刮取菌苔，無菌生理鹽水稀釋，根據(jù)麥?zhǔn)媳葷峁軠y(cè)細(xì)菌濃度，配成1.5×108/mL的菌液。各取0.1 mL接種于各藥物培養(yǎng)基中，小兒熱速清糖漿和感冒止咳糖漿終濃度依次為：1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312，青霉素V鉀片終濃度依次為64、32、16、8、4、2 mg/mL；同時(shí)設(shè)細(xì)菌和培養(yǎng)基對(duì)照，37℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄，無細(xì)菌生長試管中所含的最小藥物濃度即為最小抑菌濃度(MIC)。

1.4.5 小兒熱速清糖漿體內(nèi)抑菌實(shí)驗(yàn)

耐青霉素和青霉素敏感金黃色葡萄球菌分別接種到血瓊脂平板上，37℃，18 h。根據(jù)麥?zhǔn)媳葷峁艿臐舛?，生理鹽水稀釋兩株細(xì)菌成7個(gè)濃度，分別為0.3×109CFU/mL、0.6×109CFU/mL、0.9×109CFU/mL、1.2×109CFU/mL、1.5×109CFU/mL、1.8×109CFU/mL、2.1×109CFU/mL。小鼠140只，隨機(jī)分為14組，每組10只，每只腹腔注射菌液0.2 mL，連續(xù)觀察7 d，能使小鼠全部死亡的最低細(xì)菌濃度即為最小致死量(minimum lethal dose，MLD)。小鼠168只按體重隨機(jī)分成14組，每組12只，抗青霉素敏感和耐青霉素金黃色葡萄球菌感染實(shí)驗(yàn)各7組，灌胃給藥，分為小兒熱速清糖漿高(40 mL/kg)、中(20 mL/kg)、低(10 mL/kg)組；感冒止咳糖漿組10 mL/kg；青霉素V鉀片組33 mg/kg；正常對(duì)照和模型組(均給予生理鹽水灌胃)。提前3 d給藥，第4天，除正常組，其余各組腹腔注射最小致死量菌液每只0.2 mL，繼續(xù)給藥3 d，每天1次。記錄動(dòng)物死亡數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小兒熱速清糖漿對(duì)病毒致細(xì)胞病變保護(hù)作用

FM1和RSV對(duì)MDCK和Hela細(xì)胞的TCID50分別為10-5.8和10-4。小兒熱速清糖漿對(duì)MDCK細(xì)胞TC0為0.0312，TC50為0.9750。對(duì)Hela細(xì)胞TC0為0.0156，TC50為0.1280，達(dá)菲對(duì)MDCK和Hela細(xì)胞的TC0均為0.1250 g/L，感冒止咳糖漿對(duì)MDCK和Hela細(xì)胞的TC0均為0.0156。分別感染100TCID50FM1和RSV小兒熱速清糖漿濃度為0.0312對(duì)兩種病毒抑制明顯，濃度為0.0156僅能抑制RSV，濃度為0.0078對(duì)兩種病毒均無抑制作用。感冒止咳糖漿0.0156對(duì)兩種病毒抑制明顯，達(dá)菲0.1250 g/L僅能抑制FM1。小兒熱速清糖漿對(duì)FM1和RSV的IC50分別為0.0128和0.0068。治療指數(shù)分別為TI=76.2和TI=18.8，表明小兒熱速清糖漿能有效抑制FM1和RSV致細(xì)胞病變作用。

2.2 小兒熱速清糖漿對(duì)FM1流感病毒致小鼠肺炎的影響

FM1對(duì)小鼠的半數(shù)致死量LD50為10-3.32。小兒熱速清糖漿劑量20 mL/kg和40 mL/kg能明顯降低FM1所致肺炎小鼠肺指數(shù)(P< 0.05)，見表1。正常組小鼠肺、肺泡結(jié)構(gòu)完整，支氣管上皮完整，腔內(nèi)無滲出物，壁上有散在的紅細(xì)胞。模型組肺為間質(zhì)性肺炎，肺泡壁增厚，部分肺泡融合，腔內(nèi)充有炎性細(xì)胞和漿液性滲出物，肺泡間隔血管充血，支氣管上皮細(xì)胞脫落到腔內(nèi)，管壁增厚，周圍大量的炎性細(xì)胞浸潤；與模型組相比，小兒熱速清糖漿10 mL/kg對(duì)肺的改善較為明顯，見圖1。

2.3 各組藥物對(duì)6種細(xì)菌MIC50、MIC90及累積抑菌率

小兒熱速清糖漿和感冒止咳糖漿體外對(duì)6種細(xì)菌均有很好的抑制效果，青霉素V鉀片在體外對(duì)銅綠假單胞菌無抑制作用，對(duì)其它細(xì)菌均有抑制作用，見表2。

小兒熱速清糖漿累積抑菌率為乙型溶血性鏈球菌>表皮葡萄球菌>金黃色葡萄球菌>肺炎克雷伯菌>大腸埃希菌>銅綠假單胞菌；感冒止咳糖漿的累積抑菌率為肺炎克雷伯菌>金黃色葡萄球菌>銅綠假單胞菌>大腸埃希菌>表皮葡萄球菌>乙型溶血性鏈球菌；青霉素V鉀片累積抑菌率為表皮葡萄球菌>乙型溶血性鏈球菌>金黃色葡萄球菌>肺炎克雷伯菌>大腸埃希菌>銅綠假單胞菌，見表3和4。

表1 小兒熱速清糖漿對(duì)小鼠流感病毒性肺炎的作用Table.1 Effect of Xiaoer Resuqing syrup on influenza virus-related pneumonia in mice

注: 與病毒對(duì)照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the virus control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

注:(A)正常組;(B)病毒模型組;(C)達(dá)菲組0.0364 g/kg;(D)感冒止咳糖漿組10 mL/kg;(E)小兒熱塑清糖漿40 mL/kg;(F)小兒熱塑清糖漿20 mL/kg;(G)小兒熱塑清糖漿10 mL/kg。圖1 對(duì)小鼠肺的病理形態(tài)影響(HE×200)Note.(A)Normal group.(B)Model group.(C)Duffy group 0.0364 g/kg.(D)Cold cough syrup group 10 mL/kg.(E)Xiaoer Resuqing Syrup 40 mL/kg.(F)Xiaoer Resuqing Syrup 20 mL/kg.(G)Xiaoer Resuqing Syrup 10 mL/kg.Figure.1 Effect of pathological morphology of mice lungs

菌株Strain藥物MedicineMIC 范圍MIC rangeMIC50MIC50MIC90MIC90金黃色葡糖球菌Staphylococcus aureusABC0.25～1.000.25～1.004～32 mg/mL0.500.258 mg/mL0.500.5016 mg/mL大腸埃希菌 Escherichia coliABC0.25～0.500.25～0.504～32 mg/mL0.500.5016 mg/mL0.500.5016 mg/mL銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosaABC0.25～10.25～1Not suppress0.500.50Not suppress0.500.50Not suppress肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniaeABC0.25～0.50.25～0.54～64 mg/mL0.500.2532 mg/mL0.500.5064 mg/mL表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidisABC0.25～0.500.25～0.504～16 mg/mL0.500.508 mg/mL0.500.5016 mg/mL乙型溶血性鏈球菌Beta hemolytic streptococcusABC0.25～0.500.25～1.004～32 mg/mL0.250.5016 mg/mL0.500.5032 mg/mL

注:(A)小兒熱速清糖漿;(B)感冒止咳糖;(C)青霉素V鉀片。

Note.(A)Xiaoer Resuqing Syrup.(B)Cold cough syrup.(C)Penicillin V potassium.

表3 小兒熱速清糖漿和感冒止咳糖漿對(duì)6種細(xì)菌的累積抑菌率 (%)Table.3 Accumulative inhibitory rates of Xiaoer Resuqing syrup and cold cough syrup on six different bacteria

注:(A)小兒熱速清糖漿;(B)感冒止咳糖漿。

Note.(A)Xiaoer Resuqing Syrup.(B)Cold cough syrup.

表4 青霉素V鉀片對(duì)6種細(xì)菌的累積抑菌率(%)Table.4 Accumulative inhibitory rates of penicillin V potassium on six different bacteria

表5 小兒熱速清糖漿對(duì)青霉素敏感和耐青霉素金黃色葡萄球菌感染小鼠的保護(hù)作用 (n=12)Table.5 The protective effects of Xiaoer Resuqing syrup in mice infected with penicillin-sensitive and penicillin-resistant Staphylococcus aureus

2.4 小兒熱速清糖漿對(duì)金黃色葡萄球菌感染小鼠的保護(hù)作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明青霉素敏感和耐青霉素金黃色葡萄球菌對(duì)小鼠的MLD分別為1.2×109CFU/mL和1.5×109CFU/mL。小兒熱速清糖漿40 mL/kg對(duì)青霉素敏感和耐青霉素金黃色葡萄球菌感染的小鼠保護(hù)作用明顯，ED50分別為0.0989 mL和0.1064 mL，結(jié)果見表5。

3 討論

小兒熱速清糖漿是由柴胡、板藍(lán)根、金銀花、黃芩、水牛角、連翹、葛根、大黃組成的中藥糖漿制劑。目前，針對(duì)RSV病毒藥物主要有RSV免疫球蛋白和病毒唑，但病毒唑毒性較大，存在安全問題，而且呼吸道感染的治療存在抗生素濫用情況，既延誤病情又浪費(fèi)財(cái)力，對(duì)癥用藥非常重要[18-19]。中藥在治療病毒感染方面有其優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)，與西藥相比副作用較低。此外，在病毒感染期間我們并不能排除細(xì)菌感染的可能。本實(shí)驗(yàn)待測(cè)藥物小兒熱速清糖漿選擇呼吸道感染的主要病毒流感病毒和RSV進(jìn)行相關(guān)的抗病毒實(shí)驗(yàn)[9]，并選擇標(biāo)準(zhǔn)菌進(jìn)行抗菌試驗(yàn)，驗(yàn)證其是否同時(shí)具有抗病毒和抗菌效果。

本實(shí)驗(yàn)選擇小兒熱速清糖漿的最大無毒濃度為最大給藥劑量，在排除藥物本身毒性的條件下，連續(xù)稀釋2倍給藥，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小兒熱速清糖漿體外對(duì)FM1流感病毒、呼吸道合胞病毒致細(xì)胞病變均有抑制作用，表明有保護(hù)細(xì)胞的抗病毒作用。流感病毒是造成急性呼吸道感染的主要病原體，主要在呼吸道和肺中復(fù)制，容易引起肺炎等并發(fā)癥[20-22]。體內(nèi)抗病毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，小兒熱速清糖漿20 mL/kg和40 mL/kg均可有效的抑制流行性感冒病毒所致的病毒性肺炎，與病毒對(duì)照組比較差異顯著。小兒熱速清糖漿在體外對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌均有抑制作用，抑菌效果與感冒止咳糖漿相近，而對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌效果明顯好于青霉素V鉀片，青霉素V鉀片在體外對(duì)銅綠假單胞菌無抑制作用。金黃色葡糖球菌是引起化膿性感染的主要病菌，并且容易產(chǎn)生耐藥性，其耐藥性發(fā)病率逐年增高，死亡率也逐年遞增，已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)臨床治療的難題，亟待解決[23-24]。而小兒熱速清糖漿對(duì)青霉素敏感的金黃色葡萄球菌和青霉素耐藥的金黃色葡萄球菌感染小鼠均有很好的抑制作用。此研究首次通過實(shí)驗(yàn)證明小兒熱速清糖漿具有抗病毒以及抗菌作用，為臨床小兒熱速清糖漿治療嬰幼兒上呼吸道感染提供了理論依據(jù)，并對(duì)臨床用藥提供指導(dǎo)作用。也為急性呼吸道感染的治療目前存在的抗生素濫用、療效差、價(jià)格昂貴等問題提供了新的治療手段。

綜上所述，小兒熱速清糖漿具有一定的抗病毒和抗菌的效果，且其抗菌效果優(yōu)于抗病毒，可以考慮應(yīng)于抗生素耐藥型病菌的治療。但其抗病毒抗菌作用機(jī)制及對(duì)其他的感染性疾病是否有效果尚不清楚，仍需進(jìn)一步的研究及相關(guān)臨床試驗(yàn)。