肖洋洋，卿吉琳，李寶絢，陳柳燕，陳治中*

(1.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，南寧 530021；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，南寧 530200；3.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，南寧 530021；4.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科，山東 濱州 256603)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我國(guó)最常見的頭頸部惡性腫瘤之一，它來源于鼻咽黏膜，其病因及發(fā)病機(jī)理尚不完全清楚，但遺傳易感性、EB病毒感染以及環(huán)境因素被認(rèn)為是誘發(fā)鼻咽癌產(chǎn)生的三要素[1]。雖然世界范圍內(nèi)鼻咽癌屬于較罕見腫瘤，但其發(fā)病具有明顯的種族聚集性和地理分布等特點(diǎn)。據(jù)全球腫瘤統(tǒng)計(jì)報(bào)告，東亞及東南亞華人聚居地區(qū)是鼻咽癌的高發(fā)地區(qū)，我國(guó)主要的發(fā)病區(qū)分布于廣東、廣西、香港等南部省市地區(qū)，此地區(qū)鼻咽癌每年發(fā)病率約為20/100 000,然而在世界其他地方發(fā)病率僅為 1/100 000[2- 3]。鼻咽癌的病理類型以未分化、低分化鱗癌為主，惡性程度高，加之鼻咽癌的解剖特點(diǎn)(位置特殊隱蔽、局部淋巴結(jié)豐富)，早期癥狀輕微而不典型，不易發(fā)現(xiàn)；60%～70%鼻咽癌病例在臨床確診時(shí)已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致腫瘤難以根治，并極易復(fù)發(fā)[3]。

腫瘤的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是人類腫瘤的復(fù)制，自上世紀(jì)60年代末首次將人結(jié)腸癌細(xì)胞移植于裸鼠，利用動(dòng)物模型進(jìn)行腫瘤的研究就廣泛開展起來[4]。利用動(dòng)物模型可以直觀地觀察到腫瘤發(fā)生、發(fā)展的全過程，并可在人為控制條件下進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)研究，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、預(yù)防及治療的研究、相關(guān)疫苗的研發(fā)有著重要意義。

基于上述，鼻咽癌的動(dòng)物模型建立及研究就顯得尤為重要。鼻咽癌動(dòng)物模型的建立與其他上皮組織腫瘤大體一致，根據(jù)形成原因主要分為：自發(fā)性鼻咽癌動(dòng)物模型、誘發(fā)性鼻咽癌動(dòng)物模型、移植性鼻咽癌動(dòng)物模型、鼻咽癌轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型、轉(zhuǎn)基因和基因敲除鼻咽癌動(dòng)物模型[5- 6]。本文就相應(yīng)鼻咽癌動(dòng)物模型的建立和研究研究進(jìn)行綜述，以期為后續(xù)人鼻咽癌的研究提供依據(jù)。

1 自發(fā)性鼻咽癌動(dòng)物模型

自發(fā)性腫瘤動(dòng)物指的是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不經(jīng)人為實(shí)驗(yàn)處理而自然發(fā)生的腫瘤。它具有發(fā)生條件自然，可通過細(xì)致觀察研究發(fā)現(xiàn)新的環(huán)境致癌因素及其他致癌因素；可以著重觀察遺傳因素在腫瘤發(fā)生中的作用等優(yōu)勢(shì)，但也存在腫瘤發(fā)生情況參差不齊，難于標(biāo)準(zhǔn)化等不足。由于鼻咽癌較低的發(fā)病率，小鼠自發(fā)性鼻咽癌未有報(bào)道，但早些時(shí)候卻有報(bào)道豬、狗、貓、馬、牛等的自發(fā)性鼻咽癌[7-8]。由于發(fā)生率低，此動(dòng)物模型尚無法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

2 誘發(fā)性鼻咽癌動(dòng)物模型

誘發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型是指使用外源性致癌因素(包括物理因素、化學(xué)因素、生物因素等)在實(shí)驗(yàn)條件下誘導(dǎo)發(fā)生腫瘤的動(dòng)物模型。早期，鼻咽癌的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)研究主要局限于應(yīng)用化學(xué)致癌物。由于小鼠鼻咽部狹窄，成瘤后容易導(dǎo)致窒息死亡，故化學(xué)誘導(dǎo)的鼻咽部成瘤主要使用的動(dòng)物模型是大鼠。二亞硝基哌嗪(DNP)通過皮下注射和鼻咽局部給藥的方式曾成功用于大鼠鼻咽癌的化學(xué)誘發(fā)[9- 10]。現(xiàn)階段，DNP誘導(dǎo)的鼻咽癌動(dòng)物模型主要用于DNP致癌以及致轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究。Tang等[11]對(duì)Wistar大鼠每周兩次皮下注射DNP(40 mg/kg)，總共注射了38次誘導(dǎo)出鼻咽癌大鼠模型，并采用雙向電泳和免疫印記技術(shù)分析鼻咽癌組織的蛋白表達(dá)，得出熱休克蛋白70(heat-shock protein70，HSP-70)和粘蛋白5B(mucin 5B)可能為DNP致癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)，這為鼻咽癌化學(xué)致癌的預(yù)防和治療的研究提供了一個(gè)方向。

除了化學(xué)誘導(dǎo)以外，還可以通過感染EB病毒或其相關(guān)抗原成分來誘發(fā)鼻咽癌動(dòng)物模型。Lin等[12]通過在C57BL6 /L小鼠中皮下或通過尾靜脈注射表達(dá)EB病毒潛伏膜蛋白1(latent membrane protein 1，LMP1)的TC-1細(xì)胞成功建立了動(dòng)物模型，并得出針對(duì)LMP1的治療性疫苗在體內(nèi)抑制表達(dá)LMP1的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的結(jié)論。Wang等[13]通過EBV相關(guān)皰疹病毒(lymphocryptoviruses，LCV)的感染構(gòu)建了EB病毒感染的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型，這為鼻咽癌等EB病毒感染的相關(guān)疾病提供了病原學(xué)機(jī)制研究和疫苗研發(fā)的新的基礎(chǔ)。陳勝利[14]通過構(gòu)建人補(bǔ)體受體2(complement receptor，CR2)過表達(dá)載體并成功導(dǎo)入小鼠和豬淋巴細(xì)胞，使原不具備EB病毒感染能力的豬和小鼠淋巴細(xì)胞具備了感染能力，這為后續(xù)EB病毒誘導(dǎo)的鼻咽癌體內(nèi)成瘤動(dòng)物模型建立提供了新的思路。

3 移植性鼻咽癌動(dòng)物模型

移植性腫瘤動(dòng)物模型是指將腫瘤細(xì)胞或瘤塊移植到同種或異種動(dòng)物體內(nèi)連續(xù)傳代而形成移植性腫瘤動(dòng)物。根據(jù)移植物的來源分為腫瘤組織塊接種、瘤塊細(xì)胞懸液接種、腫瘤細(xì)胞株接種三類。接種動(dòng)物目前多采用胸腺缺失裸鼠(nude小鼠)和聯(lián)合免疫缺陷小鼠(SCID小鼠)。接種部位多為腋下、腹股溝、背部皮下，最常采用的是腋下，因有研究證明其成瘤相對(duì)較快[15]。鼻咽癌的移植性動(dòng)物模型具有成瘤快、荷瘤小鼠不易死亡、易于標(biāo)準(zhǔn)化等特點(diǎn)，故成為現(xiàn)階段鼻咽癌研究最常采用的動(dòng)物模型。

早在21世紀(jì)初，陳志堅(jiān)等[16]利用纖支鏡從鼻咽癌病人鼻咽部剪取腫瘤組織并皮下接種于BALB/c裸鼠和Scid小鼠，成功構(gòu)建三個(gè)人來源的鼠移植瘤株，通過免疫組化觀察均可見EB病毒晚期膜蛋白LMP-1和LMP-2陽性細(xì)胞，確認(rèn)此三株是鼻咽癌免疫治療研究的理想動(dòng)物模型。此后，隨著人鼻咽癌細(xì)胞株的分離和建立，越來越多的研究者采用體外培養(yǎng)的鼻咽癌細(xì)胞株進(jìn)行體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)。Li等[17]通過BABL/c裸鼠腹部側(cè)面皮下接種鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2、5-8F并利用siRNA干擾的方式，評(píng)估成瘤，得出干擾超氧化物岐化酶1(superoxide dismutase1，SOD1)活性可以抑制鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)并增加脂質(zhì)積聚的結(jié)論，這揭示了鼻咽癌中的活性氧(reactive oxygen species，ROS)狀態(tài)與腫瘤形成的關(guān)系，為鼻咽癌的預(yù)后提供了一個(gè)新的生物標(biāo)記物，并可能為鼻咽癌的治療提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)。Yip等[18]通過使用Rho相關(guān)激酶抑制劑(Y-27632)，對(duì)NOD / SCID小鼠皮下注射1×107/只鼻咽癌細(xì)胞系成瘤成功，建立了除C666外的新的EBV+ve鼻咽癌細(xì)胞系，此細(xì)胞系兼有EB病毒游離體，并可誘導(dǎo)EB病毒的再激活以及產(chǎn)生感染性病毒顆粒。這為鼻咽癌和EB病毒相關(guān)性的研究提供了新的調(diào)查工具，并將為鼻咽癌的發(fā)病機(jī)理研究做出貢獻(xiàn)。

近年來，隨著基因重組技術(shù)和熒光成像技術(shù)的發(fā)展，鼻咽癌細(xì)胞株通過增添綠色熒光蛋白蛋白基因并穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白感染小鼠成瘤，利用活體成像技術(shù)更能直觀明了的觀察腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移以及干預(yù)效果的評(píng)價(jià)。Liu等[19]通過建立了人鼻咽癌細(xì)胞株5-8F-GFP和6-10B-GFP移植到裸鼠皮下，通過熒光成像技術(shù)觀察到兩株細(xì)胞在鼠體內(nèi)與人體內(nèi)一致的侵襲轉(zhuǎn)移能力。Wei等[20]利用慢病毒將胚胎干細(xì)胞關(guān)鍵蛋白(GFP-Nanog)整合基因?qū)隒NE-2和SUNE-1細(xì)胞株，并篩選出具有腫瘤干細(xì)胞特性的陽性克隆，將其移植到NOD/Scid小鼠，利用熒光成像技術(shù)揭示了細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞(cytokine-induced killer cell，CIK)通過NKG2D配體對(duì)腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)的殺傷作用。這也是熒光動(dòng)物模型在鼻咽癌研究中的重大貢獻(xiàn)，預(yù)示著此模型將在鼻咽癌研究中發(fā)揮越來越重要的作用。

因小鼠鼻咽部解剖學(xué)的特點(diǎn)，不利于鼻咽部原位移植成瘤模型的建立。這樣就需要較大型動(dòng)物的鼻咽癌模型。兔體型較大，生物學(xué)及轉(zhuǎn)移特性等都與人類相似，便于復(fù)制人類鼻咽癌原位模型并進(jìn)行后續(xù)的研究。胡月等[21]詳細(xì)總結(jié)并比較了兔鼻咽移植瘤模型建立的現(xiàn)狀，為鼻咽癌兔模型的建立提供了一個(gè)非常可行的參考。

4 鼻咽癌轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型

鼻咽癌的侵襲轉(zhuǎn)移分為瘤旁侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移兩類，瘤旁轉(zhuǎn)移以顱底轉(zhuǎn)移為主，也包括頸部、鼻腔等，遠(yuǎn)處可轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)、肝、肺、骨髓等器官[22]。因?yàn)楸茄拾┙馄饰恢玫奶厥庑?，故發(fā)現(xiàn)時(shí)多已轉(zhuǎn)移，這樣對(duì)鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移作用機(jī)制及干預(yù)措施的研究就顯得極為重要。鼻咽癌轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型的建立以移植為主。

根據(jù)移植細(xì)胞株的處理方式不同分為直接移植模型和篩選移植模型。直接移植是指將人鼻咽癌細(xì)胞株通過注射等方式直接到達(dá)特定器官，然后看腫瘤在靶器官的生長(zhǎng)以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況及影響因素。Cai等[23]利用此方法將熒光化的5-8F細(xì)胞移植到麻醉的裸鼠肝包膜下并使其繼續(xù)生長(zhǎng)3周，通過活體熒光成像觀察肝、肺、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，通過此模型得出EB病毒編碼的microRNA BART1通過調(diào)節(jié)PTEN依賴的途徑誘導(dǎo)鼻咽癌的轉(zhuǎn)移。這為鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移的研究提供了一個(gè)完整的模型和思路。篩選移植指的是先體內(nèi)注射鼻咽癌細(xì)胞株并篩選出不同器官親和性的轉(zhuǎn)移細(xì)胞瘤亞株，并利用此亞株進(jìn)行后續(xù)的相關(guān)器官轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。韓春等[24]利用BALB/c裸鼠脾內(nèi)注射5-8F細(xì)胞株并利用熒光成像觀察肝臟轉(zhuǎn)移情況，篩選出親肝臟的鼻咽癌細(xì)胞亞株5-8F-H3B，這為鼻咽癌的肝轉(zhuǎn)移提供了一個(gè)十分有價(jià)值的模型。

此外，同時(shí)采用的由皮下移植建立的鼻咽癌動(dòng)物模型和由化學(xué)誘導(dǎo)劑DNP誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移性鼻咽癌的動(dòng)物模型廣泛的應(yīng)用在DNP誘導(dǎo)的鼻咽癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制方面的研究。Peng等[25]對(duì)裸鼠尾靜脈注射人鼻咽癌低轉(zhuǎn)移細(xì)胞6-10B，然后腹腔注射DNP，通過評(píng)估轉(zhuǎn)移腫瘤的重量來了解DNP對(duì)鼻咽癌轉(zhuǎn)移的影響，利用此模型得出DNP通過介導(dǎo)熱休克蛋白70-2(heat-shock protein 70-2，HSP 70-2)的表達(dá)促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

5 轉(zhuǎn)基因鼻咽癌動(dòng)物模型

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是應(yīng)用實(shí)驗(yàn)的方法將外源基因?qū)氲皆缙诘呐咛?nèi),使之可以在動(dòng)物染色體基因組內(nèi)穩(wěn)定的整合,并能遺傳給后代的一類動(dòng)物。自從上世紀(jì)80年代Gordon等[26]首次通過顯微注射將外源DNA注入小鼠受精卵成功獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物以來，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物越來越多用于人類疾病的研究中，尤其是腫瘤的研究。

在鼻咽癌的研究中，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物也越來越多的被應(yīng)用到。早在1990年，Wilson等[27]通過構(gòu)建LMP基因BNLF-1的質(zhì)粒表達(dá)載體PyLMP并顯微注射到小鼠受精卵中，得到鼻粘膜過度角質(zhì)化的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。隨后，該團(tuán)隊(duì)又采用此方法利用EB病毒的ED-L2啟動(dòng)子，構(gòu)建了鼻咽癌組織來源的LMP1基因(LMP1CAO)和B95-8淋巴細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)株來源的LMP1基因(LMP1B95-8)兩個(gè)LMP1變異體轉(zhuǎn)基因小鼠模型并以此進(jìn)行相關(guān)研究，得出鼻咽癌組織來源的EB病毒LMP1上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(transforming growth factor α，TGFα)伴隨增生，同時(shí)隨后上調(diào)p16和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)，這揭示了LMP1在鼻咽癌形成和進(jìn)展中的作用機(jī)制[28]。何迎春等[29]通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建了含突變型p53基因和LMP1基因的真核表達(dá)載體并注射入小鼠受精卵，得到含兩者的雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型并命名為TgN(p53mt-LMP1)/HT mice，且表現(xiàn)為鼻咽黏膜上皮的灶狀增生。后續(xù)采用此模型的研究也取得了一定成果[30]。除了轉(zhuǎn)基因小鼠模型外，非哺乳動(dòng)物模型也已用到鼻咽癌研究中來。Wei等[31]利用轉(zhuǎn)基因表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2的斑馬魚模型觀察鼻咽癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)移中的血管生成能力，間接反映鼻咽癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力。得出LMP1對(duì)鈣池調(diào)控的鈣內(nèi)流(store-operated calcium entry, SOCE)的調(diào)節(jié)作用，以及阻斷其作用可以減少鼻咽癌的轉(zhuǎn)移和血管生成。

6 幾種模型的比較

鼻咽癌動(dòng)物模型主要有自發(fā)性鼻咽癌動(dòng)物模型、誘發(fā)性鼻咽癌動(dòng)物模型、移植性鼻咽癌動(dòng)物模型、鼻咽癌轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型、轉(zhuǎn)基因和基因敲除鼻咽癌動(dòng)物模型。除自發(fā)性動(dòng)物模型外，其余按實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌Ｓ糜诒茄拾┑难芯俊?/p>

誘發(fā)性鼻咽癌動(dòng)物模型的優(yōu)勢(shì)是它考慮了人體腫瘤的致瘤因素，與人體腫瘤較為相似，且成瘤慢，符合人腫瘤動(dòng)力學(xué)特征，常用于篩選致癌物、腫瘤的預(yù)防以及綜合化療等方面的研究，缺點(diǎn)是腫瘤產(chǎn)生的個(gè)體變異較大，難于標(biāo)準(zhǔn)化，不易同時(shí)獲得病程或癌塊大小較均一的動(dòng)物供實(shí)驗(yàn)治療之用，再加之腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征常是多種多樣，故不常用于藥物篩選，腫瘤的基因研究等。

移植性鼻咽癌動(dòng)物模型是目前鼻咽癌的研究中最常用的動(dòng)物模型，大多采用人鼻咽癌的細(xì)胞株異種移植到免疫缺陷裸鼠皮下成瘤，適用于短時(shí)間內(nèi)需要得到大量相同腫瘤模型的實(shí)驗(yàn)，這種模型所產(chǎn)生的腫瘤具有個(gè)體差異較小、成瘤快、生長(zhǎng)速率較一致、可觀察到腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過程的特點(diǎn)，故常用于基因的過表達(dá)或沉默所引起的鼻咽癌的成瘤以及侵襲轉(zhuǎn)移能力改變的研究。轉(zhuǎn)移性鼻咽癌動(dòng)物模型大多采用移植的形式，廣義上說應(yīng)屬于移植性動(dòng)物模型，但由于移植部位的特殊性，能直觀觀察到腫瘤細(xì)胞對(duì)特定器官的親和性以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況，這是皮下移植的鼻咽癌動(dòng)物模型無法比擬的。

轉(zhuǎn)基因鼻咽癌動(dòng)物模型是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)準(zhǔn)確增強(qiáng)或失活某些特定基因的表達(dá)，目前只有關(guān)于LMP1的轉(zhuǎn)基因鼻咽癌小鼠模型，此模型已經(jīng)為鼻咽癌的成因研究得出了許多重要成果，此外，已經(jīng)有學(xué)者對(duì)鼻咽癌的遺傳易感基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的建立進(jìn)行了嘗試，這將會(huì)為鼻咽癌的遺傳易感性方面的研究提供方向[32]。

7 結(jié)語

鼻咽癌是我國(guó)高發(fā)的頭頸部腫瘤，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，且發(fā)現(xiàn)時(shí)多已轉(zhuǎn)移，傳統(tǒng)治療效果不佳。同其他腫瘤的研究一樣，從分子層面上揭示其發(fā)生及發(fā)展機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)是目前鼻咽癌的研究熱點(diǎn)。動(dòng)物研究是基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用于臨床的前提，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的發(fā)展推動(dòng)鼻咽癌的基礎(chǔ)研究并為轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用提供可能性。以上綜述了五種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型及其應(yīng)用，每一種模型在鼻咽癌研究中又各有其特點(diǎn)。所以在研究中選擇合適的動(dòng)物模型并在原有基礎(chǔ)上進(jìn)行創(chuàng)新和改造，完善適合自己的方法，這對(duì)鼻咽癌的診斷和治療具有重要的意義。