吳夢(mèng)雨，鄧 博，賈立群*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院，北京 100029)

化療相關(guān)性腹瀉(Chemotherapy-induced Diarrhea，CID)是腫瘤患者化療引起的一種常見消化道毒副反應(yīng)。近年來化療藥物的廣泛應(yīng)用，CID的發(fā)生率也在逐年提高。尤其是5-氟尿嘧啶(5-FU)持續(xù)靜脈滴注和伊立替康(Irinotecan, CPT-11)所致的遲發(fā)性腹瀉成為臨床治療的難點(diǎn)[1]。CID不僅會(huì)降低患者的生活質(zhì)量，還會(huì)增加患者住院費(fèi)用和治療時(shí)間,嚴(yán)重者還可能會(huì)導(dǎo)致水和電解質(zhì)紊亂、脫水、感染等，化療被迫中斷，更甚者休克甚至危及生命[2]。與其他化療引起的消化道反應(yīng)如惡心、嘔吐相比，CID的病理生理機(jī)制至今尚未完全清楚，其治療方案也不同于一般性腹瀉，因此開展CID的防治研究有極為重要的意義。良好的人類疾病動(dòng)物模型是推動(dòng)醫(yī)學(xué)研究發(fā)展的重要工具，在CID的相關(guān)研究及治療方法的探索上，一定程度上需要依賴動(dòng)物模型得以實(shí)現(xiàn)，本文就國(guó)內(nèi)外已開展的各種CID研究的動(dòng)物模型構(gòu)建方法進(jìn)行綜述，以期為CID的預(yù)防、治療以及預(yù)后提供安全可靠的造模參考。

臨床上化療相關(guān)性腹瀉常表現(xiàn)為大便次數(shù)增多，出現(xiàn)軟便、稀便或水樣便，并伴有腹脹、胃脘疼痛、全身乏力等癥狀。美國(guó)國(guó)家癌癥研究所發(fā)布的不良事件術(shù)語標(biāo)準(zhǔn)[3]根據(jù)化療前后患者大便次數(shù)的增加情況對(duì)化療所致腹瀉嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)價(jià)和分級(jí)，但并未將糞便特征、伴隨癥狀等進(jìn)行完整評(píng)估。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中常依照Kurita的方法[4]進(jìn)行腹瀉程度評(píng)分(0分：大便正常或沒有；1分：輕度腹瀉，大便輕微濕軟；2分：中度腹瀉，大便較濕且不成形，有輕度肛周著色；3分：重度腹瀉，水樣便并伴有重度肛周著色)，腹瀉評(píng)分的顯著差異是評(píng)價(jià)腹瀉模型的標(biāo)準(zhǔn)。

1 CID荷瘤動(dòng)物模型

1.1 荷瘤小鼠模型

(1)CPT-11

Cheng等[5]為了驗(yàn)證細(xì)菌β-G特異性抑制劑對(duì)化療藥物腸毒性的作用，以Balb/cJ(Balb/c ByJNarl)小鼠為受試對(duì)象，構(gòu)建CID荷瘤小鼠模型。首先在小鼠右側(cè)脅部皮下注入CT26結(jié)腸癌細(xì)胞，待瘤體達(dá)10～50 mm3時(shí)(約9 d)開始灌胃。隨后連續(xù)10 d予CPT-11 50 mg/kg腹腔注射，制備腹瀉模型。結(jié)果末次化療后第7天，CPT-11組所有小鼠發(fā)生腹瀉，并有一半表現(xiàn)為嚴(yán)重腹瀉，而化合物灌胃組只有50%小鼠腹瀉，但兩組腫瘤生長(zhǎng)情況無差異，表明該藥能抑制CPT-11誘導(dǎo)的腹瀉，并保持化療效果。Kong等[6]同樣構(gòu)建了Balb/cJ小鼠CT26結(jié)腸癌模型后，予CPT-11 50 mg/kg腹腔注射連續(xù)12 d，在化療第7天時(shí)觀察到50%的小鼠出現(xiàn)腹瀉，第8天達(dá)到65%，第12天時(shí)皮膚糞便染色更深、液體更多。彭罡等[7]觀察中藥復(fù)方生姜瀉心湯對(duì)CPT-11導(dǎo)致的遲發(fā)性腹瀉的影響，選取雌性ICR小鼠，采用陳永康等[8]的方法，腹腔注射10 mg/kg AOM 1 d，2% DSS水飼養(yǎng)1周，然后正常飲水2周，連續(xù)4個(gè)周期，誘發(fā)小鼠結(jié)直腸癌。隨后連續(xù)4 d腹腔注射CPT-11 36.8 mg/kg，末次注射后觀察到模型組和生姜瀉心湯組均100%發(fā)生不同程度的腹瀉，且與正常對(duì)照組相比有顯著性差異，說明造模成功。Lam等[9]采用一次性注射給藥的方法，將小鼠結(jié)腸癌38細(xì)胞接種到雌性BDF1小鼠皮下，10～14 d待成瘤后一次性腹腔注射大劑量CPT-11 350 mg/kg，48 h開始出現(xiàn)顯著的體重下降和腹瀉，并可觀察到空腸粘膜結(jié)構(gòu)的破壞。

(2)5-FU

5-FU一般采取一次性大劑量注射的方法造模，符彩選等[10]探討片仔癀對(duì)荷瘤小鼠5-FU所致毒副作用的影響，采用腫瘤細(xì)胞懸液接種法，于化療前接種于雄性Balb/c小鼠右前肢腋窩處皮下，建立CT26結(jié)腸癌移植瘤模型。成瘤后分組，5-FU組一次性腹腔注射5-FU 150 mg/kg?；熀罂梢?-FU組小鼠毛無光澤，反應(yīng)遲鈍，腹瀉發(fā)生率100%。

1.2 荷瘤大鼠CID模型

(1)CPT-11

Gibson等在DA大鼠上復(fù)制乳腺癌模型[11-12]，之后化療組連續(xù)兩天接受CPT-11腹腔注射150 mg/kg，結(jié)果25%的大鼠在第一次注射后立即出現(xiàn)輕度腹瀉，2%進(jìn)展為中度腹瀉。24 h后4%的大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉，48 h內(nèi)增加到18%，72 h至40%，然后96 h下降到16%。

Xue等選擇特別適用于研究嚴(yán)重遲發(fā)性腹瀉和臨床相關(guān)劑量限制性毒性的Ward結(jié)腸腫瘤移植到雌性Fisher 344大鼠，并將大鼠分為四組分別尾靜脈注射不同劑量的CPT-11(75、100、125、150 mg/(kg·d)，連續(xù)3 d)以測(cè)定其最大耐受量[13-14]。結(jié)果表明125 mg/(kg·d)可誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生嚴(yán)重的遲發(fā)性腹瀉，且死亡率最低，腹瀉持續(xù)一周。而100 mg/(kg·d)腹瀉發(fā)生率低，150 mg/(kg·d)會(huì)造成43%的死亡率。

(2)5-FU+奧沙利鉑

5-FU+奧沙利鉑是廣泛用于治療結(jié)直腸癌的化療方案， Mi等[15]嘗試用多種方法制備結(jié)直腸癌模型動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)常見的化學(xué)致癌物質(zhì)二甲基亞砜(DMH)誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c臨床具有相似特征，但更耗時(shí)；皮下注射SW480細(xì)胞，腫瘤生長(zhǎng)較快，但形成率低。因此其嘗試使用聯(lián)用的方法，即SD大鼠皮下注射DMH 10周，然后注射SW480細(xì)胞，在直腸黏膜建立模型，結(jié)果兩周腫瘤形成率達(dá)到96.67%。隨后采用5-FU 75 mg/kg+奧沙利鉑 8 mg/kg的化療方案連續(xù)3 d腹腔注射。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠均無死亡，但化療組出現(xiàn)嚴(yán)重的體重下降和腹瀉。

(3) 達(dá)克替尼

達(dá)克替尼是一種口服、強(qiáng)效和具有選擇性的不可逆小分子抑制劑，用于攜帶EGFR激活突變的局部晚期或轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌患者的一線治療，其最常見的不良反應(yīng)就是腹瀉，發(fā)生率可達(dá)73%[16]。Van Sebille等[17]探究其腹瀉的發(fā)生機(jī)制，選用荷瘤雄性Wistar大鼠，達(dá)克替尼7.5 mg/(kg·d)口服21 d，制備腹瀉模型，結(jié)果腹瀉(1～3級(jí))發(fā)生率100%，與臨床試驗(yàn)中的發(fā)病率相當(dāng)，說明造模成功。

荷瘤的CID動(dòng)物模型廣泛應(yīng)用于各種治療CID的藥物以及各種化療藥物腸毒性機(jī)制的研究，以上方法被證實(shí)能夠有效模擬人體化療后腸毒性的發(fā)生發(fā)展過程，其制備方法值得借鑒。荷瘤模型能夠保證受試動(dòng)物在腫瘤生長(zhǎng)和化療腸毒性的反應(yīng)上保持一致，同時(shí)可以驗(yàn)證治療藥物是否促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)或干擾細(xì)胞毒性。但缺點(diǎn)是造模時(shí)間長(zhǎng)、個(gè)體差異大、存活率難保證且花費(fèi)大，導(dǎo)致研究受限。

2 非荷瘤模型

2.1 非荷瘤小鼠

(1)CPT-11

羅振濤等[18]參照Ikuno[19]的方法造模，選用雄性Balb/c小鼠，腹腔注射CPT-11 75 mg/kg，連續(xù)4 d，小鼠逐漸出現(xiàn)體重下降、精神萎靡、厭食等癥狀，4 d后，腹瀉率達(dá)100%，肛周皮膚粘膜紅腫，大便次數(shù)明顯增多，較濕且不成形，部分呈水樣便，腹瀉癥狀持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。上述模型已被國(guó)內(nèi)外學(xué)者[20-24]反復(fù)多次應(yīng)用于CID防治藥物的研究中，成模率較高，值得借鑒。另有國(guó)內(nèi)的研究[25]選用雄性ICR小鼠尾靜脈注射CPT-11 35 mg/(kg·d)，連續(xù)4 d，末次注射24 h后，小鼠均出現(xiàn)不同程度的稀便、粘液便、肛周污穢。

(2)5-FU

5-FU所致腸毒性對(duì)腸粘膜屏障的損傷較重，易導(dǎo)致胃腸道粘膜炎(gastrointestinal mucositis，GIM)，包括嚴(yán)重的腹瀉、惡心、嘔吐和厭食等癥狀。Sakai等[26]]給予雄性C57BL/6腹腔注射50 mg/kg共4 d，可觀察到明顯的體重下降和腹瀉癥狀。Hamouda等[27]同樣選用雄性C57BL/6小鼠，化療延長(zhǎng)至6 d，第5天開始出現(xiàn)嚴(yán)重的體重下降，平均體重下降至83.6；第3天開始出現(xiàn)廣泛腹瀉，第6天平均腹瀉評(píng)分2.8分；最后藥物引起嚴(yán)重的絨毛縮短、隱窩減少等腸粘膜炎特征。不同學(xué)者[28-30]通過評(píng)價(jià)各種生理指標(biāo)和病理變化，分別在ICR小鼠、SD大鼠等不同動(dòng)物中驗(yàn)證了該造模方法的可行性，均可見到廣泛的腹瀉癥狀和腸粘膜炎癥狀，因此該方法可用于對(duì)化療粘膜炎性所致腹瀉的研究。

2.2 非荷瘤大鼠

(1)CPT-11

Trifan[31]等評(píng)估了CPT-11總劑量和分次劑量對(duì)大鼠腹瀉模型的影響。發(fā)現(xiàn)CPT-11注射總劑量越高，腹瀉越嚴(yán)重；但是另一方面，連續(xù)2 d尾靜脈注射CPT-11 150 mg/(kg·d)較連續(xù)4 d注射80 mg/(kg·d)腹瀉更重且死亡率更低。因此其采用150 mg/(kg·d)連續(xù)2 d注射的方法造模，末次注射48 h后出現(xiàn)遲發(fā)性腹瀉，72 h達(dá)到最嚴(yán)重，且沒有大鼠死亡。Deng等[32]采用同樣的方法造模，末次注射CPT-11 24 h后，大鼠出現(xiàn)不同程度的腹瀉、進(jìn)食減少等表現(xiàn)，說明造模成功，但其中兩組分別有1只大鼠在化療過程中死亡。張程亮等[33]探究沙利度胺對(duì)CPT-11所致腹瀉的治療作用，采用60 mg/kg的CPT-11連續(xù)注射4 d制備大鼠腹瀉模型，大鼠體重明顯下降，給藥結(jié)束后第2天出現(xiàn)腹瀉癥狀，并在第4天達(dá)到高峰，隨后癥狀逐漸減輕，說明化療劑量的控制對(duì)于化療后腹瀉程度和死亡率的影響十分重要。

(2)5-FU

胃腸粘膜炎可能是引起CID的主要因素，其特征是吸收不均衡[34]。Eiichi等[35]選擇了足以誘導(dǎo)Wistar大鼠腸粘膜損傷但不足以致死的劑量，采用中心靜脈注射5-FU 100 mg/kg連續(xù)4 d(實(shí)驗(yàn)共7 d)，大鼠從第4天開始表現(xiàn)嚴(yán)重的水樣腹瀉，并出現(xiàn)毛發(fā)豎立等膿毒癥樣癥狀；病理顯示空腸壁變薄甚至透明，粘膜下層疾病消失。該模型毒性反應(yīng)較重，適用于對(duì)胃腸粘膜損傷的研究。Abalo等[36]制備Wistar大鼠CID模型，首先使用單一劑量5-FU 150 mg/kg腹腔注射，在給藥后4 d發(fā)現(xiàn)無法觀測(cè)到腹瀉的放射學(xué)征象。因此加用第2天150 mg/kg(累積劑量達(dá)300 mg/kg)，使累積劑量達(dá)到類似靜脈途徑和口服途徑，可以觀察到有效的腹瀉征象，適用于研究。

非荷瘤模型能夠排除其他混雜因素，單獨(dú)研究化療藥物對(duì)腹瀉和腸粘膜的毒性的影響，且造模方法簡(jiǎn)便快速、價(jià)格低廉，復(fù)制成功率高，動(dòng)物死亡率相對(duì)較低，可操作性強(qiáng)。在大鼠和小鼠的選擇上，大鼠體表面積大，所需的實(shí)驗(yàn)成本相對(duì)較高，而小鼠具有成本低、生長(zhǎng)快、易于大批繁殖、取材方便等優(yōu)點(diǎn)，因此在貴重藥品或者毒性藥品易造成動(dòng)物死亡的實(shí)驗(yàn)中可考慮選用小鼠。

3 基因敲除動(dòng)物模型

基因敲除動(dòng)物是應(yīng)用基因敲除技術(shù)和胚胎干細(xì)胞技術(shù)制作出來的在個(gè)體基因組特定位點(diǎn)上的目的基因被刪除或滅活的一類動(dòng)物，其遺傳改變非常清楚，可以研究以前經(jīng)典遺傳無法了解的基因表現(xiàn)型效應(yīng)[37]。目前，基因敲除小鼠化療腸毒性模型應(yīng)用日趨廣泛，5-FU是常見的造模藥物。Sezaki等[38]為研制Fn14基因敲除小鼠CID模型，采用雄性Balb/c野生型小鼠(WT)和Fn14基因敲除(Fn14KO)小鼠腹腔注射5-FU 250 mg/kg，各組均未見造模后死亡。野生型組小鼠5-FU給藥后第3天開始出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉，并在整個(gè)研究期間持續(xù)，而Fn14KO小鼠腹瀉較輕，表明Fn14表達(dá)增加化療誘導(dǎo)腹瀉和破壞TWIME/FN14途徑可能潛在地預(yù)防5-FU誘導(dǎo)的腹瀉。Sano等[39]為探究H2受體拮抗劑拉呋替丁通過TRPV1信號(hào)通路對(duì)腸粘膜的保護(hù)作用，選取雄性C57BL/6野生型(WT)和TRPV1基因敲除型(TRPV1KO)小鼠，腹腔注射50 mg/kg，連續(xù)6 d，制備CID模型，基因敲除的小鼠化療開始后體重明顯下降，并從第4天開始觀察到明顯的腹瀉，第6天平均腹瀉評(píng)分達(dá)3分。表明TRPV1信號(hào)為其誘導(dǎo)感覺傳入神經(jīng)元必不可少的途徑。

基因敲除動(dòng)物模型對(duì)于研究動(dòng)物遺傳特性和疾病相關(guān)基因功能更有針對(duì)性，具有靶向性的特點(diǎn)。但其缺點(diǎn)在于，基因敲除小鼠的培育過程較為復(fù)雜和困難， 需要較高的技術(shù)要求，更加耗時(shí)、耗力，且成功率低；其次，研究所敲除的基因有可能是具有致命功能的基因，動(dòng)物易在胚胎早期發(fā)生死亡，成活率低；并且如果被敲除的基因可被其他具有多功能的基因造成功能代償， 這樣便失去了基因敲除的意義，致使基因型改變變得模糊，無法得到可靠的研究結(jié)果。但是對(duì)于基因工程動(dòng)物來說，作為功能基因的驗(yàn)證工具，制作的前提是已有明確的科學(xué)假設(shè)，如確定的靶基因或通路，因此繁育困難的問題基本可以解決。隨著我國(guó)支持基礎(chǔ)研究的力度越來越大，生命科學(xué)領(lǐng)域的不斷發(fā)展，基因工程動(dòng)物的應(yīng)用會(huì)更加普遍、前景更加廣闊。

4 小結(jié)

由于不同的化療藥物所致的腹瀉有著不同的發(fā)生機(jī)制和病理基礎(chǔ)，因此其腹瀉癥狀和病理改變也不盡相同。目前臨床上常見的引起CID的藥物主要為CPT-11和5-FU，研究者需要明確研究目的和研究?jī)?nèi)容，選擇合適的動(dòng)物?；熕幬锏氖褂蒙?，要考慮藥物種類、總劑量、給藥方法和次數(shù)，爭(zhēng)取達(dá)到最大程度的腹瀉發(fā)生，且動(dòng)物死亡率低，可操作性強(qiáng)、易復(fù)制。構(gòu)建實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是間接反映人類疾病的手段和方法，是研究人類疾病發(fā)生發(fā)展的必要途徑，需符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理要求，讓實(shí)驗(yàn)動(dòng)物最大程度的發(fā)揮其實(shí)驗(yàn)作用，為相關(guān)人類疾病的研究和防治提供可靠的參考依據(jù)。