雷 蕾，刀 慶，牛成慧，韓雁冰

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，昆明 650032)

調(diào)寧蛋白(calponin)是一種表達(dá)于平滑肌細(xì)胞及非肌細(xì)胞(神經(jīng)元、成纖維細(xì)胞、人絨毛膜癌細(xì)胞等)中的調(diào)節(jié)蛋白，它們能與肌動(dòng)蛋白結(jié)合，抑制由肌動(dòng)蛋白激活的肌球蛋白ATP酶的活性，是一個(gè)分子量在34 × 103～ 37 × 103(292 ～ 330個(gè)氨基酸)的肌動(dòng)蛋白家族。

1 調(diào)寧蛋白概述

Calponin最早發(fā)現(xiàn)于雞砂囊平滑肌組織中，參與平滑肌的收縮調(diào)節(jié)[1]。在早期對(duì)蛋白結(jié)合作用的研究中發(fā)現(xiàn)，calponin能與肌動(dòng)蛋白(actin)[2]、交聯(lián)蛋白(cross-links actin)[3]、鈣調(diào)蛋白(calmodulin)[4]、原肌球蛋白(tropomyosin)[5]、肌球蛋白(myosin)[6]、結(jié)蛋白(desmin)[7]、微管蛋白(tubulin)[8]、鈣調(diào)素結(jié)合蛋白(caldesmon)[9]、凝溶膠蛋白(gelsolin)[10]結(jié)合，參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞骨架維持等多種功能調(diào)節(jié)。

目前在脊椎動(dòng)物中，已分離出calponin的三種異構(gòu)體。根據(jù)其等電點(diǎn)(isoelectric point，pI)的不同，分為堿性調(diào)寧蛋白(h1-calponin，pI=9.4)、中性調(diào)寧蛋白(h2-calponin，pI=7.5)、酸性調(diào)寧蛋白(h3-calponin，pI=5.2)[11]。通過(guò)在多種物種中對(duì)這三種calponin異構(gòu)體cDNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，h2-calponin和h3-calponin的前273個(gè)氨基酸殘基與h1-calponin高度相似，但其羧基末端序列有較大的差異，從而導(dǎo)致三種異構(gòu)體不同的分子量大小和電荷[12-13]。這三種異構(gòu)體是其三種同源基因的產(chǎn)物。在人類基因組里，編碼h1-calponin的CNN1基因位于染色體19p13.2-p13.1[14]，編碼h2-calponin的CNN2基因位于19p13.3[15]，編碼h3-calponin的CNN3基因位于1p22-p21[16]。這三種基因亞型表現(xiàn)出不同的組織及細(xì)胞特性。H1-calponin主要表達(dá)于終末分化和非增殖性的平滑肌細(xì)胞中，參與平滑肌的收縮調(diào)控[17]。H2-calponin在組織中則有更為廣泛的分布，包括平滑肌細(xì)胞、表皮角質(zhì)細(xì)胞[18]、成纖維細(xì)胞[19]、肺泡細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞[20]、髓系白細(xì)胞[21]。H3-calponin在平滑肌細(xì)胞及非肌細(xì)胞中均有發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為在神經(jīng)元重塑中參與肌動(dòng)蛋白的調(diào)節(jié)[22]。

2 酸性調(diào)寧蛋白的分子生物學(xué)特點(diǎn)

H3-calponin最初發(fā)現(xiàn)于大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌中，該蛋白前273個(gè)氨基酸殘基與h1-calponin具有高度同源性，但在羧基末端的剩余57個(gè)殘基組成了一個(gè)特殊的強(qiáng)酸性質(zhì)的結(jié)構(gòu)域，與纖維狀肌動(dòng)蛋白(filamentous actin，F(xiàn)-actin)結(jié)合，受鈣離子和鈣調(diào)蛋白的調(diào)節(jié)[23]。體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，h3-calponin和h1-calponin與F-actin競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。H3-calponin與F-actin之間親和力較高，兩者的解離常數(shù)Kd值為：1.6 × 105(mol/L)-1，具有濃度依賴性，當(dāng)h3-calponin與肌動(dòng)蛋白分子摩爾比值為1∶1～1∶2時(shí)，兩種蛋白的結(jié)合趨于飽和。與h1-calponin能與多種蛋白結(jié)合的特性不同，雖然h3-calponin與F-actin有結(jié)合位點(diǎn)，但與結(jié)蛋白、原肌球蛋白、鈣調(diào)蛋白、S100(一種鈣結(jié)合蛋白)、磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)囊泡沒(méi)有較高親和力，且h3-calponin對(duì)肌動(dòng)球蛋白Mg2+-ATP酶的活性抑制沒(méi)有明顯作用，這提示h3-calponin與h1-calponin的生化功能有差異。為探究其耐熱性，將h3-calponin加熱至95℃后置于0℃冰浴中3 min，再在70 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min后，80%的蛋白聚集成顆粒狀變性失活，表明h3-calponin不具有熱穩(wěn)定性[24]。H3-calponin獨(dú)特的分子生物學(xué)特點(diǎn)決定了其獨(dú)有的生物學(xué)作用。

3 酸性調(diào)寧蛋白的生物學(xué)作用

自上世紀(jì)80年代calponin被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，對(duì)其研究涉及各類細(xì)胞組織，但h3-calponin作為調(diào)寧蛋白家族中的一員，迄今是研究最少的。隨著對(duì)h3-calponin研究的深入，對(duì)該蛋白生物學(xué)作用有更進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。

3.1 酸性調(diào)寧蛋白參與樹突棘重塑

H3-calponin在多種細(xì)胞組織中均有分布，但主要分布于腦組織中。Trabelsiterzidis等[25]通過(guò)免疫印跡和免疫熒光定位分別在豬、大鼠腦組織和大鼠小腦組織中分別發(fā)現(xiàn)分子量約為36 × 103～ 37 × 103和35 × 103～ 36 × 103的調(diào)寧蛋白樣蛋白表達(dá)，使用等電聚焦的方法，證實(shí)與Applegate等[23]報(bào)道的蛋白一致，表明h3-calponin在腦組織中也有表達(dá)。H3-calponin集中于神經(jīng)元軸突的生長(zhǎng)錐、成熟小腦及皮質(zhì)細(xì)胞的膜下區(qū)域，并且在體內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，如放射狀膠質(zhì)細(xì)胞，膠質(zhì)界膜，Bergmann膠質(zhì)細(xì)胞，成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞中也富集[26]。在海馬超微結(jié)構(gòu)研究中發(fā)現(xiàn)，h3-calponin存在于對(duì)稱性(抑制性GABA能受體)突觸的突觸后膜，并聚集于非對(duì)稱性(興奮性谷氨酸能受體)突觸的突觸后致密物(post-synaptic density，PSD)中。此外，h3-calponin沿著樹突棘的微管分布，并與之連接，而這些微管參與樹突棘形狀和大小的改變，提示h3-calponin可能在樹突棘重塑過(guò)程中發(fā)揮作用[27]。

在氯化鋰-匹羅卡品致癇大鼠模型中，谷氨酸能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)發(fā)生重組，表現(xiàn)為顆粒細(xì)胞軸突的異常出芽，新生突觸形成，樹突棘重塑。Ferhat等[28]在此模型中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大鼠呈癲癇持續(xù)狀態(tài)時(shí)，海馬齒狀回顆粒細(xì)胞的樹突大量減少，3 d后其樹突棘開始再生，并在15 d后達(dá)到穩(wěn)定。樹突棘的再生可能是由原有顆粒細(xì)胞中新的樹突棘形成和/或癲癇誘導(dǎo)下新生顆粒細(xì)胞樹突棘發(fā)育而成。該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)h3-calponin的表達(dá)水平是在樹突棘密度增加的時(shí)期上升，猜測(cè)h3-calponin參與新的樹突棘形成。而在癲癇急性期，h3-calponin的表達(dá)水平在樹突棘內(nèi)有迅速的升高，并且其升高發(fā)生在樹突棘形態(tài)及齒狀顆粒細(xì)胞密度的重塑過(guò)程中，表明h3-calponin參與樹突棘的重塑。在隨后研究中，Rami等[22]發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中，h3-calponin不僅存在于樹突棘中，也存在于樹突軸中，并且過(guò)表達(dá)的h3-calponin通過(guò)調(diào)整肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重組和動(dòng)力學(xué)改變，來(lái)調(diào)節(jié)樹突棘的形態(tài)學(xué)以及密度，使樹突棘棘突延長(zhǎng)，樹突棘密度增加。

物理因素刺激下，h3-calponin的表達(dá)水平也會(huì)發(fā)生變化。在聲波振動(dòng)(40 Hz)的干預(yù)下，過(guò)表達(dá)的h3-calponin，通過(guò)調(diào)節(jié)離子型谷氨酸受體，使鈣離子濃度上升，最終誘導(dǎo)樹突棘的重塑發(fā)生[29]。

3.2 酸性調(diào)寧蛋白參與細(xì)胞骨架重組

H3-calponin通過(guò)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組，影響細(xì)胞增殖、粘附、遷移、分化、吞噬和融合。Calponin中的CLR(calponin-like repeat)三拷貝串聯(lián)重復(fù)序列構(gòu)成了兩個(gè)獨(dú)立的肌動(dòng)蛋白結(jié)合位點(diǎn)(actin-binding site，ABS)。其中，ABS1能在體外與F-actin結(jié)合，ABS2能與不含雙CH結(jié)構(gòu)域形成的F-actin結(jié)合域(F-actin-binding domain，ABD)的蛋白質(zhì)相結(jié)合。Calponin能與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架相結(jié)合基于ABS1、ABS2和羧基末端序列的特性。H3-calponin主要與F-actin相互作用抑制肌動(dòng)蛋白在肌球蛋白上滑動(dòng)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重組。Shibukawa等[30]發(fā)現(xiàn)在滋養(yǎng)層細(xì)胞融合過(guò)程中，h3-calponin羧基末端的S293/296位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，觸發(fā)h3-calponin羧基末端的磷酸化，高度磷酸化的h3-calponin促進(jìn)肌動(dòng)球蛋白的收縮，促使細(xì)胞骨架重組。此外，h3-calponin作為μ-鈣蛋白酶(μ-calpain)水解產(chǎn)物，能被μ-calpain水解，提示h3-calponin參與由μ-calpain調(diào)節(jié)的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重組過(guò)程[31]。

3.3 酸性調(diào)寧蛋白參與平滑肌細(xì)胞收縮調(diào)控

在平滑肌細(xì)胞中，肌動(dòng)蛋白纖維組成的微絲參與肌肉的收縮[32]。Daimon等[33]在皮膚傷口愈合過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞增殖分化為肌成纖維細(xì)胞，h3-calponin在此類細(xì)胞增殖期表達(dá)，并參與α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)形成應(yīng)力纖維。該團(tuán)隊(duì)同時(shí)利用慢病毒轉(zhuǎn)染，使成纖維細(xì)胞細(xì)胞中CNN3基因下調(diào)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CNN3基因缺陷的成纖維細(xì)胞不能形成強(qiáng)有力的應(yīng)力纖維，從反面驗(yàn)證h3-calponin在肌動(dòng)蛋白纖維的形成過(guò)程中發(fā)揮作用。

3.4 酸性調(diào)寧蛋白參與骨骼肌發(fā)育調(diào)節(jié)

H3-calponin在骨骼肌發(fā)育中起重要作用。Liang等[34]基于對(duì)豬骨骼肌中microRNA和mRNA配對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，CNN3基因受miR-1的調(diào)控。進(jìn)一步通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)證實(shí)在骨骼肌發(fā)育過(guò)程中，h3-calponin在mRNA上的表達(dá)水平與miR-1呈顯著的負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果表明，h3-calponin參與骨骼肌發(fā)育調(diào)節(jié)，并且CNN3是與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)聯(lián)的基因。

3.5 酸性調(diào)寧蛋白參與胎盤形成與胚胎發(fā)育

細(xì)胞融合對(duì)胎盤發(fā)育和成熟至關(guān)重要。蛋白組學(xué)研究顯示h3-calponin在人和小鼠胎盤組織中均有表達(dá)，并調(diào)節(jié)胎盤中滋養(yǎng)層細(xì)胞融合。在下調(diào)CNN3基因表達(dá)后，反而促發(fā)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組和合胞體的形成，提示h3-calponin在滋養(yǎng)層細(xì)胞融合過(guò)程中起負(fù)性調(diào)節(jié)的作用[30]。在人類胎盤形成過(guò)程中，胎兒的滋養(yǎng)層細(xì)胞分化為侵襲型和非侵襲型，h3-calponin在低氧條件下，通過(guò)激活p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)生侵襲[35]。Flemming等[36]通過(guò)運(yùn)用基因靶向技術(shù)分別敲除小鼠CNN1、CNN2、CNN3基因，發(fā)現(xiàn)敲除了CNN3基因的小鼠由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育缺陷在胚胎期和新生期即出現(xiàn)很高的死亡率，表明h3-calponin在胚胎形成期起關(guān)鍵性作用。

3.6 酸性調(diào)寧蛋白參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是指，通過(guò)細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)的受體在細(xì)胞通過(guò)時(shí)感受到信息分子的刺激，由細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)轉(zhuǎn)換，從而影響細(xì)胞生物學(xué)功能的過(guò)程。在成纖維細(xì)胞遷移過(guò)程中，h3-calponin通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)介導(dǎo)的l-鈣調(diào)素結(jié)合蛋白的磷酸化，參與其遷移過(guò)程[37-38]。MEKK1是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路中的重要成員，MEKK1介導(dǎo)的h3-calponin發(fā)生磷酸化，增加細(xì)胞外基質(zhì)的粘附性及細(xì)胞表明張力，增強(qiáng)細(xì)胞的收縮力[39]。

4 酸性調(diào)寧蛋白的臨床應(yīng)用

H3-calponin的表達(dá)變化與多種疾病的發(fā)生進(jìn)展相關(guān)，可輔助臨床上多種疾病的診斷及其預(yù)后的判斷。Han等[40]通過(guò)基因芯片掃描發(fā)現(xiàn)，耐藥性癲癇患者腦內(nèi)的CNN3基因的表達(dá)明顯上調(diào)。對(duì)耐藥性癲癇患者腦組織以及顳葉癲癇大鼠腦組織中的h3-calponin進(jìn)行檢測(cè)，其表達(dá)水平較正常組有明顯的升高，提示h3-calponin在腦內(nèi)的表達(dá)與癲癇活動(dòng)程度密切相關(guān)。該團(tuán)隊(duì)同時(shí)對(duì)不同發(fā)作程度癲癇患者腦脊液中h3-calponin進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，反復(fù)癲癇發(fā)作患者的腦脊液中，h3-calponin的表達(dá)水平明顯升高，提示腦脊液中的h3-calponin水平能夠作為一種潛在的與癲癇發(fā)作相關(guān)的生物標(biāo)記物，并利于癲癇和耐藥性癲癇的鑒別診斷。Nakarai等[41]在大腸癌患者術(shù)后組織標(biāo)本中檢測(cè)到h3-calponin的表達(dá)上調(diào)顯著，并且更具有特異性和穩(wěn)定性，認(rèn)為h3-calponin的表達(dá)水平可作為大腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的檢測(cè)指標(biāo)，可作為大腸癌淋巴結(jié)早期轉(zhuǎn)移的診斷標(biāo)志。在對(duì)CNN3基因與疾病關(guān)系的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤中CNN3基因發(fā)生重排[42]，而在卵巢癌中，CNN3的表達(dá)與該疾病進(jìn)程相關(guān)[43]。雖然需要進(jìn)一步的研究以明確CNN3的有效性，但以CNN3為診斷或治療靶點(diǎn)的臨床方法具有很大實(shí)施潛力。

5 小結(jié)及展望

自calponin發(fā)現(xiàn)以來(lái)已有三十余年，作為肌動(dòng)蛋白相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白，它在參與平滑肌收縮和非肌細(xì)胞活動(dòng)方面被研究的頗為廣泛。H3-calponin雖是calponin家族最“年輕”的成員，但隨著對(duì)h3-calponin的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)發(fā)現(xiàn)，它不僅僅在調(diào)控神經(jīng)元可塑性中起主要作用。對(duì)這三種基因的起源研究顯示CNN3相對(duì)于另外兩種基因更古老，提示h3-calponin可能更能代表calponin蛋白的本質(zhì)，值得未來(lái)更深入的研究。