王宇虹，曲光瑾，肖 沖，鄧 巍*

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院干部病房，哈爾濱 150001； 2.解放軍總醫(yī)院國家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100039； 3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京 100021)

巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)是一種分布廣泛的古哺乳動物病毒，遺傳證據(jù)表明目前進(jìn)化的CMV與宿主在哺乳動物物種具有共同的祖先[1]。人類巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)在人群中廣泛感染，其全球感染率高達(dá)60% ～ 100%[2]。在免疫活性宿主體內(nèi)，HCMV保持終生持續(xù)感染的能力，無論原發(fā)性還是復(fù)發(fā)性HCMV感染通常都是亞臨床的[3]。因此，對于免疫功能正常的HCMV攜帶者，HCMV逃避宿主高水平的抗病毒免疫反應(yīng)，與宿主終身穩(wěn)定共存，其免疫逃避機制一直是免疫研究的重要挑戰(zhàn)。而對于免疫功能障礙的感染者，HCMV可導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病，甚至致死，這對HCMV的疫苗開發(fā)和藥物治療提出了重要的挑戰(zhàn)[4]。對于免疫衰老的HCMV攜帶者，病毒的免疫逃避機制，與免疫適應(yīng)性集中體現(xiàn)的免疫衰老之間的相互作用，則更加微妙復(fù)雜[5]。

由于β-皰疹病毒類具有種屬特異性，導(dǎo)致HCMV病毒不能在任何動物模型直接研究[6]。每個物種的CMV高度適應(yīng)其各自的宿主物種，這種高度種屬特異的CMV基因組特點，反映了其與宿主密切的進(jìn)化關(guān)聯(lián)性。鼠類由于不具有CD28丟失性，無法針對其進(jìn)行CMV感染后免疫衰老機制的研究[7]，因此首選非人靈長類動物進(jìn)行CMV慢性潛伏再激活誘導(dǎo)免疫衰老的動物模型構(gòu)建。HCMV最接近的種屬是黑猩猩，由于價格、飼養(yǎng)和倫理等問題，并不是一個具有良好可行性的CMV動物模型，所以獼猴CMV(rhesus cytomegalovirus，RhCMV)感染模型是目前研究HCMV感染的最優(yōu)選非人靈長類動物模型。從宿主角度，感染RhCMV的圈養(yǎng)和野生猴子無處不在；而且RhCMV的感染宿主內(nèi)也存在和人類一樣的慢性潛伏再激活的反復(fù)免疫誘導(dǎo)機制[8]。從病毒角度，RhCMV和HCMV基因組的大小、結(jié)構(gòu)和基因組織相似。RhCMV的基因組突變與HCMV基因組的突變具有共線性，近60%潛在致病蛋白與HCMV蛋白具有同源性，這些同源蛋白主要集中在病毒的結(jié)構(gòu)和免疫調(diào)節(jié)蛋白，G蛋白偶聯(lián)受體和蛋白參與核酸代謝、DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白[9]。故本文從宿主三個免疫狀況角度，分別闡述人類巨細(xì)胞病毒HCMV和獼猴巨細(xì)胞病毒RhCMV的感染免疫研究現(xiàn)狀。

1 免疫活性正常的HCMV感染和RhCMV感染的免疫狀況

HCMV在大多數(shù)健康人的早年原發(fā)感染，隨即啟動終身潛伏感染。在潛伏期間，病毒發(fā)生頻繁的再激活，反復(fù)感染，病毒反復(fù)的復(fù)制表達(dá)，誘導(dǎo)人免疫系統(tǒng)產(chǎn)出HCMV特異性抗病毒免疫清除和炎性反應(yīng)，使病毒始終處于亞臨床狀況[3]。宿主的免疫系統(tǒng)能有效的控制病毒傳播，但是與絕大多數(shù)抗病毒免疫反應(yīng)可以有效保護(hù)宿主免受病毒入侵和再次感染不同，HCMV仍可廣泛原發(fā)感染、持續(xù)終生并且定期繼發(fā)機會性感染。其自身的免疫適應(yīng)性和選擇性壓力使其自身擁有數(shù)百萬年的免疫逃避優(yōu)勢；另一方面，宿主始終無法清除潛伏在骨髓干細(xì)胞的病毒儲存池，由此產(chǎn)生了不同病毒株的超級感染[10]。RhCMV廣泛存在于種群中，在性成熟的年齡(2.5 ～ 3歲)，血清陽性率達(dá)到100%左右，這導(dǎo)致原發(fā)性RhCMV研究的成本激增。通過對隔離的幼年恒河猴進(jìn)行原發(fā)感染，證實RhCMV的感染形式與人類很接近。RhCMV在首次感染后建立了終生潛伏感染，病毒的宿主內(nèi)播散發(fā)生在唾液、淚液、尿液、排泄物、精液、母乳和宮腔中[11]。自然暴露實驗接種RhCMV感染的健康免疫獼猴臨床癥狀輕微，病理、組化和尸檢顯示RhCMV在多種組織和器官內(nèi)多種細(xì)胞內(nèi)有宿主內(nèi)播散，且與HCMV-DNA陽性細(xì)胞分布高度相近[12]。

CMV的免疫逃避機制是CMV持續(xù)終生感染的重要機制，包括非常復(fù)雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。由HCMV編碼的眾多具有免疫調(diào)節(jié)功能的蛋白，可以干擾宿主細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，活化細(xì)胞內(nèi)和跨細(xì)胞運輸以及細(xì)胞的凋亡[13]。大多數(shù)編碼RhCMV免疫調(diào)節(jié)蛋白與HCMV的同源性低，但體外研究顯示出相似的功能，HCMV細(xì)胞凋亡抑制機制也存在于RhCMV。RhCMV中的UL36(caspase-8介導(dǎo)凋亡，病毒抑制劑)和UL37(線粒體凋亡抑制，vMIA)同源基因的突變能夠阻止Fas介導(dǎo)的在HeLa細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡[14]。

HCMV的UL111A開放閱讀框架與人IL-10呈現(xiàn)高度同源，HCMV表達(dá)病毒源性IL-10是其免疫逃避的重要機制之一[15]。RhCMV中也發(fā)現(xiàn)了IL-10表達(dá)，呈現(xiàn)出針對宿主體液免疫的抑制性[16]。與HCMV IL-10類似，RhCMV能在獼猴體內(nèi)表達(dá)病毒源性IL-10(cIL-10)，它與獼猴宿主表達(dá)的IL-10有25% ～ 27%的同源性，因此，自然感染RhCMV的獼猴中可檢測到抗病毒IL-10的抗體[17]。HCMV的MHC-I表達(dá)下調(diào)機制，是其另一個重要的免疫逃避機制，RhCMV的US2、US3、US6、US11基因組里有相似的基因家族[18]，而嚙齒類動物US2 ～ US11基因家族則無類似的免疫逃避機制。RhCMV-US28.5編碼一個包含五個同源基因的突變病毒趨化因子受體，與人類HCMV-US28同源，而嚙齒類無此基因。靈長類動物特有的七跨膜結(jié)構(gòu)域基因家族，可進(jìn)一步顯示HCMV和RhCMV的同源性[19]。

雖然對HCMV感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答的性質(zhì)尚不完全確定，HCMV誘導(dǎo)的病毒特異性免疫必須被視為宿主保護(hù)機制。通過對病毒自然感染史的研究，證實HCMV反復(fù)機會性感染誘導(dǎo)的中和抗體和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)，能有效抑制HCMV感染升級和CMV相關(guān)疾病發(fā)生[20]。RhCMV誘導(dǎo)猴宿主的免疫保護(hù)性反應(yīng)與人類一致。磷酸化蛋白65(pp65)是HCMV免疫反應(yīng)的主要目標(biāo)之一，RhCMV-pp65-2定位于細(xì)胞核，也是獼猴體液免疫和細(xì)胞免疫的目標(biāo)[21]。在健康獼猴中，RhCMV特異性CTL反應(yīng)也具有MHC-I限制性，其靶蛋白Rh-IE1和Rh-IE2，與HCMV靶蛋白同源[22]。此外，RhCMV的特異性中和抗體的時間變化曲線和人HCMV也高度相似，且中和抗體的靶蛋白也均為病毒殼表面的糖蛋白(GB)。體外處理克隆的RhCMV GB和HCMV GB其水解產(chǎn)物相近，且存在抗體交叉反應(yīng)[23]。存在于免疫系統(tǒng)的靶向IE1/IE2，GB和pp65使RhCMV成為研究CMV疫苗的可行模式。

2 免疫功能低下患者的HCMV感染和RhCMV感染的免疫狀況

HCMV感染在健康人身上通常無癥狀，但此病毒是免疫功能不成熟或低下患者的發(fā)病和死亡的重要病因之一，也是艾滋病和移植受體機會性感染常見的危及生命的并發(fā)癥[24]。免疫功能低下時免疫系統(tǒng)已經(jīng)不能控制HCMV的原發(fā)感染或潛伏期的再激活。HCMV先天感染是美國出生缺陷傳染病原因的重要原因，僅在美國，與巨細(xì)胞病毒病有關(guān)的衛(wèi)生保健費用就超過每年44億美元[25]。免疫系統(tǒng)功能低下的獼猴也能觀察到嚴(yán)重的RhCMV病。實驗接種病毒的獼猴胎兒，中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生異常的風(fēng)險與胎盤的母體IgG轉(zhuǎn)移到胎兒的RhCMV免疫反應(yīng)呈負(fù)相關(guān)[21]。監(jiān)測類似于人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染過程的RhCMV的反應(yīng)，在攜帶RhCMV的獼猴上構(gòu)建猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)感染模型，隨之進(jìn)行免疫抑制能夠產(chǎn)生特征性RhCMV播散病變，與人類移植受體和HIV患者的HCMV播散方式高度雷同[25]?？傊瑹o論是人類還是獼猴，宿主免疫功能和CMV之間的博弈結(jié)果，決定了CMV感染的臨床結(jié)局。在針對宿主抗移植物的研究中，研究者擬應(yīng)用抗CD40和CD28抗體延長移植腎的存活時間，有趣的是，在獼猴上應(yīng)用CD40/CD28抗體后，RhCMV再感染被顯著激活，出現(xiàn)播散性CMV病[26-27]，這與下文講到的“CMV-免疫衰老”悖論相關(guān)。

3 免疫衰老的“健康”個體的HCMV感染和免疫衰老的相關(guān)性探究

免疫衰老的“健康”老年人，本身即存在一個邏輯悖論。因為衰老的退行性變是一個基因調(diào)控的不可逆過程，免疫系統(tǒng)也不能獨善其身。在一個健康的老年個體中，免疫功能無異常和年輕免疫活性的免疫系統(tǒng)仍存在很多差異，而健康衰老的定義，目前仍是一個極大的挑戰(zhàn)。一方面，持續(xù)終生的HCMV反復(fù)再感染誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，可能是老年個體免疫衰老的重要責(zé)任病原體。老人宿主外周血中，一半以上的效應(yīng)記憶T細(xì)胞(effector memory CD8+T cells，EM CD8+T cells)均為HCMV特異性的T細(xì)胞。這種HCMV特異性T細(xì)胞的高度克隆化的累積效應(yīng)，“壓縮”了外周血初始T細(xì)胞的數(shù)量，使老年個體針對新抗原的識別能力和T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)多樣性降低。另一方面，來自相對健康的高齡老人人群的流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，HCMV的反復(fù)再激活與預(yù)期壽命呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，而不是預(yù)測的負(fù)相關(guān)，因此還有研究者推測HCMV在老年個體免疫衰老的漫長進(jìn)程中，可能發(fā)揮一個“低水平疫苗樣炎性刺激”作用，進(jìn)而避免了老年個體遭受高致病性新病原體感染后的“免疫休克時間窗”，從而降低了衰老個體的死亡率[28]。

4 靈長類動物模型在HCMV誘導(dǎo)免疫衰老機制中的重要性

CMV的進(jìn)化變異與物種相關(guān)性具有平行關(guān)系，靈長類動物的CMV基因組與嚙齒類動物病毒基因組相比，其相互關(guān)聯(lián)性顯著增高。最廣泛使用的鼠CMV(MCMV)解決生物學(xué)和免疫學(xué)的很多基本問題，但是和HCMV基因組有很多不同，MCMV存在許多“非必需基因”[29]。此外，免疫衰老作為一個衰老個體發(fā)生的增齡性退行性改變，也是進(jìn)化壓力產(chǎn)生的調(diào)適性改變。HCMV誘導(dǎo)的免疫衰老最重要的表型之一是CD28的丟失，HCMV特異性CD28nullCD8+T細(xì)胞的增高，是人類免疫衰老風(fēng)險表型群的獨立風(fēng)險因素之一[30]，鼠的T細(xì)胞表面的CD28從不丟失，這降低了鼠模型在免疫衰老中的研究價值[7]。HCMV潛伏于骨髓中無法清除，是HCMV終生反復(fù)感染的最重要機制，目前的研究重點已經(jīng)從HCMV的反復(fù)再激活，前推到HCMV在骨髓干細(xì)胞的潛伏階段。既往應(yīng)用原代細(xì)胞和體外細(xì)胞系的實驗感染，已經(jīng)證實了分子水平上HCMV基因表達(dá)復(fù)雜調(diào)控的斷面網(wǎng)絡(luò)，這些研究主要集中在MIE基因即時表達(dá)調(diào)控[31-32]。因為干細(xì)胞的HCMV再激活表型的關(guān)鍵在于MIE基因的表達(dá)從靜止變?yōu)橛|發(fā)，細(xì)胞轉(zhuǎn)錄抑制因子通過組蛋白翻譯后的修飾，構(gòu)建一個染色質(zhì)結(jié)構(gòu)依賴的轉(zhuǎn)錄抑制機制，相關(guān)問題還有很多，例如：HCMV長期在髓系細(xì)胞中攜帶，這個潛在的基因組如何維持呢？它們生命的某個階段，是否發(fā)生增殖？HCMV潛在的復(fù)制起點是什么？HCMV基因組運輸和重新激活高度被限制是如何實現(xiàn)的？最近的研究表明UL84可維持病毒序列，一批具有強大的長期抗凋亡功能的細(xì)胞蛋白在潛伏感染的CD34+細(xì)胞中上調(diào)，提示HCMV擁有一個與眾不同的抗凋亡體系[33]。伴隨基因表達(dá)技術(shù)的高速發(fā)展，越來越多的證據(jù)提示HCMV潛伏其實是一個高度活躍的過程，其中涉及延遲特定基因產(chǎn)物以及定時編排，這些編排時間相關(guān)性變化幫助病毒維持潛伏感染，調(diào)節(jié)HCMV潛伏的骨髓內(nèi)干細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境以利于病毒的潛伏。HCMV攜帶細(xì)胞骨髓干細(xì)胞的獲取，在臨床上缺乏實踐性。通過在獼猴干細(xì)胞獲取染色質(zhì)表型，以及多種組學(xué)的同步研究，對明確HCMV的潛伏再激活機制，從潛伏期抑制病毒再激活，從而阻斷免疫衰老的核心途徑，都是非常有前景的假說[34]。

綜上，研發(fā)RhCMV作為人類巨細(xì)胞病毒的動物模型的時代已經(jīng)到來。恒河猴動物和細(xì)胞模型已應(yīng)用了許多關(guān)于基因組細(xì)菌編輯、細(xì)胞標(biāo)記和人工染色體突變的先進(jìn)技術(shù)，由于成本和近親繁殖淘汰率高的原因，靈長類不會取代小鼠在巨細(xì)胞病毒生物學(xué)和免疫學(xué)的應(yīng)用，但對于許多重要的科學(xué)問題，如疫苗研制、藥物開發(fā)、潛伏的CMV感染與免疫衰老，非人靈長類正迅速成為首選動物模型。