張 坤，徐昊淼，程 涓，趙 勇，許亞梅*

(1.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700； 2.中國科學院動物所，北京 100101)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是髓系造血干祖細胞惡性克隆的疾病，表現(xiàn)為原始細胞的分化障礙和惡性增殖。白血病細胞多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是化療失敗的主要原因，耐藥蛋白可在多種細胞內高表達[1-2]，MDR細胞具有很強的抗凋亡特性，因此尋求能抑制耐藥蛋白表達及誘導MDR細胞凋亡的新藥是目前研究的熱點之一[3-4]。動物模型是新藥探索、篩選評價的重要基礎。本研究應用急性早幼粒細胞HL60及耐阿霉素(adriamycin，ADR)細胞HL60/ADR，構建穩(wěn)定、有效、重復性好的急性髓系白血病模型，模擬臨床白血病累及骨髓和全身播散的特點，為研究人類白血病耐藥機制及藥物治療奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF級雌性SCID beige小鼠15只，體重(15.98±0.57) g，4 ～ 5周齡，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供[SCXK (京) 2017-0022]。飼養(yǎng)于中國科學院動物研究所屏障環(huán)境動物房[SYXK (京) 2013-0015]，含復合維生素B的標準顆粒飼料、飲水、墊料及一切與鼠接觸的物品經滅菌處理，動物實驗室溫度保持在25℃左右，相對濕度保持在40% ～ 70%，每日光照12 h，適應性飼養(yǎng)一周。實驗方案通過北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院實驗動物管理和使用委員會(IACUC)審批(2015-68)。

1.1.2 實驗細胞株

HL60、HL60/ADR細胞株自中國醫(yī)學科學院血液病研究所購入，接種于10 cm細胞培養(yǎng)皿，以含10%血清的培養(yǎng)基于37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 ～ 3 d傳代，HL60/ADR在含阿霉素0.5 μg/mL的10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中維持耐藥，實驗前一周撤藥。

1.2 主要試劑與儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基(北京利維寧生物科技有限公司)，DMEM高糖培養(yǎng)基(美國HyClone公司)，胎牛血清(天津康源生物技術有限公司)，青霉素和鏈霉素各100 U/mL(Sigma)，anti-human CD13-PE、anti-human CD33-FITC(Thermo Fisher)。CO2培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)，臺式冷凍離心機(美國Thermo Scientific，型號Sorvall Legend RT)，X-ray生物學輻照儀(RS-2000 PRO Biological System)、流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司，型號Epics XL)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及HL60、HL60/ADR細胞移植

將15只SCID beige小鼠隨機分為對照組3只、四組模型12只(每組3只)。移植前24 h內均照射2GyX射線，模型組分別經尾靜脈接種對數(shù)生長期HL60細胞懸液1 × 107個/只(M1組)、5 × 106個/只(M2組)，HL60/ADR細胞懸液1 × 107個/只(M3組)、5 × 106個/只(M4組)，對照組鼠尾靜脈注射等劑量生理鹽水。實驗過程中按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。

1.3.2 SCID beige小鼠發(fā)病情況觀察

觀察SCID beige小鼠發(fā)病情況及生存期，測量實驗動物體重變化情況。

1.3.3 SCID beige小鼠外周血常規(guī)及血涂片檢測

照射前和接種后第10、18、28天分別經尾靜脈取80 μL外周血，置于EDTA抗凝管中，送至北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院檢驗科測定外周血中白細胞(white blood cell，WBC)、血紅蛋白(hemoglobin，HGB)含量和血小板(platelet，PLT)。同時取外周血吉姆薩-瑞氏染色后，油鏡下觀察細胞形態(tài)，每片計數(shù)100個細胞，計算白血病細胞的比例。

1.3.4 檢測CD13、CD33表達情況

CD13、CD33是髓系細胞表面分化抗原，特別是在分化早期階段[5]，故應用流式細胞技術檢測外周血中CD13、CD33表達，并采用人源anti-human CD13-PE、anti-human CD33-FITC進行標記檢測HL60細胞[6]。照射前和接種后第10、18、28天分別經尾靜脈取50 μL外周血，加入2 μL肝素抗凝，加入1.8 mL二蒸水低滲裂解紅細胞及血小板20 s后，加入0.2 mL MPBS終止反應，離心后棄去上清，每個樣本加5 μL CD13-PE、CD33-FITC，混勻，37℃避光孵育30 min后，上流式細胞儀測定CD13、CD33細胞比例。

1.3.5 SCID beige小鼠骨髓細胞學檢查

于瀕死前斷髓，剝離股骨、脛骨，放入平皿，剪去骨骺兩端，并用1 mL注射器吸取PBS緩沖液沖洗股骨骨干，沖出骨髓細胞，沖3 ～ 4次，用注射器吸取骨髓液，慢慢將骨髓液經濾網注入離心管中，去除殘渣，1700 r/min離心5 min，倒上清，加入1 mL紅細胞裂解液(25 s)，再加PBS至10 mL，1700 r/min離心5 min，倒掉上清，最后得到的白色沉淀為骨髓細胞，加入50 μL胎牛血清反復吹打重懸，進行骨髓細胞涂片細胞學檢查。

1.3.6 小鼠組織病理檢查

第32天或瀕死前處死小鼠，取其脾、肝、腎等臟器及肉眼可見瘤塊，脾稱重，并將取出的臟器及瘤塊于4%甲醛固定24 h，然后進行常規(guī)石蠟包埋切片，切片厚度為2 μm，行HE染色，并在顯微鏡下觀察白血病細胞浸潤。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 SCID beige小鼠的生存狀態(tài)觀察

模型M1、M3組接種細胞7 d后，開始出現(xiàn)豎毛、萎靡少動等表現(xiàn)，隨著時間的延長，逐漸出現(xiàn)脊背弓起、步態(tài)不穩(wěn)、偏側或轉圈，模型M2、M4組在接種細胞10 d后出現(xiàn)上述癥狀(圖1)。M1組分別于接種28 d、29 d各死亡1只，M3組于接種29 d死亡1只。至觀察周期32 d，M1、M3組生存率分別為33%、67%，M2、M4組全部生存(圖2)。

注：A：接種28 d模型組小鼠瘦弱、萎靡；B：瀕死前小鼠狀態(tài)。圖1 SCID beige小鼠經尾靜脈接種細胞后生存狀態(tài)Note. A: Emaciated and flagging appearance of model groups at day 28. B: Agonal living state of the mouse.Figure 1 Living state of SCID beige mice after inoculation

圖2 造模各組小鼠生存曲線Figure 2 Survival curves of the four model groups

四組模型鼠、對照組鼠經X線照射后7 d內體重均下降，各模型組體重隨著時間的推移逐漸下降，接種第28天較第0天體重明顯降低，M1、M3兩組下降更為顯著，均低于對照組(P< 0.05)。

2.2 血常規(guī)檢測及外周血細胞形態(tài)變化

各組小鼠經X線照射7 d內白細胞迅速降低，隨時間推移，逐漸上升，第28天各模型組白細胞計數(shù)均顯著高于對照組，各模型組間差異無顯著性，見表2；經X線照射SCID beige小鼠的血紅蛋白含量下降，對照組第18天時恢復至一般水平，第28天M1、M3模型組血紅蛋白含量均明顯低于對照組，且M3組下降最為顯著，見表3；照射后各組小鼠血小板計數(shù)一過性迅速減少，隨時間推移，均逐漸回升，M2組小鼠血小板回升最明顯，較其他組別明顯增多，見表4。

表1 SCID beige小鼠各組體重變化Table 1 Changes in body weights of SCID beige mice in the five groups

注：M1組：接種HL60細胞1 × 107個/只；M2組：接種HL60細胞5 × 106個/只；M3組：接種HL60/ADR細胞1 × 107個/只；M4組：接種HL60/ADR細胞5 × 106個/只。下表同。與第0天比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. M1 group: inoculated with 1 × 107HL60 cells per mouse; M2 group: inoculated with 5 × 106HL60 cells per mouse; M3 group: inoculated with 1 × 107HL60/ADR cells per mouse; M4 group: inoculated with 5 × 106HL60/ADR cells per mouse. The same in the following tables. Compared with data obtained before X-ray irradiation,*P< 0.05,**P< 0.01.

表2 SCID beige小鼠各組外周血白細胞數(shù)變化Table 2 Changes in numbers of while blood cells in peripheral blood of SCID beige mice in the five groups

注：與第0天比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with data obtained before X-ray irradiation,*P< 0.05,**P< 0.01.

表3 SCID beige小鼠各組外周血血紅蛋白含量變化Table 3 Changes in hemoglobin levels in peripheral blood of SCID beige mice in the five groups

注：與第0天比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with data obtained before X-ray irradiation,*P< 0.05,**P< 0.01.

鏡下HL60、HL60/ADR細胞多呈圓形或橢圓形，細胞核大而圓，占3/4面積以上，細胞質量少為深藍色(HL60、HL60/ADR細胞形態(tài)見圖3，模型組外周血涂片見圖4)。每只接種1 × 107個細胞的M1、M3組小鼠外周血涂片中第10天開始偶見白血病細胞，M2、M4兩組則于接種第18天觀察到白血病細胞，由于SCID beige小鼠的T、B淋巴細胞功能缺失，并具備beige小鼠典型的自然殺傷細胞(natural killing cells，NK)功能缺陷，且經過X線2Gy預處理后，骨髓造血功能受到明顯抑制，外周血涂片中少見有核細胞，白血病細胞比例難以統(tǒng)計，第21天時每片可計數(shù)100個細胞，M1組白血病細胞比例最高，至第28天時造模四組外周血白血病細胞比例均明顯增多，M3組最為顯著，見表5。對照組外周血涂片始終未見白血病細胞。

表4 SCID beige小鼠各組外周血血小板計數(shù)變化Table 4 Changes in numbers of platelets in peripheral blood of SCID beige mice in the five groups

注：與第0天比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with data obtained before X-ray irradiation,*P< 0.05,**P< 0.01.

注：A：HL60細胞形態(tài)；B：HL60/ADR細胞形態(tài)。圖3 細胞形態(tài)(吉姆薩-瑞氏染色，× 1000)Note. A: HL60 cell morphology. B: HL60/ADR cell morphology.Figure 3 Cell morphology. Wright Giemsa staining

注：A：接種HL60小鼠外周血白血病細胞形態(tài)；B：接種HL60/ADR小鼠外周血白血病細胞形態(tài)。圖4 模型組小鼠外周血白血病細胞形態(tài)(吉姆薩-瑞氏染色，× 1000)Note. A: Leukemic cell morphology in peripheral blood after HL60 cell inoculation. B: Leukemic cell morphology in peripheral blood after HL60/ADR cell inoculation.Figure 4 Leukemic cell morphology in peripheral blood. Wright Giemsa staining

時間(d)Days白血病細胞比例Proportion of leukemia cellsM1組M1 groupM2組M2 groupM3組M3 groupM4組M4 groupP值P-value215.47±0.874.33±0.763.83±0.953.60±0.460.0752814.34±1.63*12.68±0.53**15.41±0.89**12.64±0.56**0.025

注：與第21天比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with data obtained at 21 days after inoculation,*P< 0.05,**P< 0.01.

表6 SCID beige小鼠各組外周血CD33陽性細胞比例變化Table 6 Changes in the rates of CD33-positive cells in peripheral blood of SCID beige mice in the five groups

注：與第0天比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with data obtained before X-ray irradiation,*P< 0.05,**P< 0.01.

表7 SCID beige小鼠各組外周血CD13陽性細胞比例變化Table 7 Changes in the rates of CD13-positive cells in peripheral blood of SCID beige mice in the five groups

注：與第0天比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with data obtained before X-ray irradiation,*P< 0.05,**P< 0.01.

2.3 外周血CD13、CD33表達變化

各模型組小鼠的CD33表達均逐漸增多，第28天時CD33陽性細胞比例顯著高于對照組，然各模型組間差異無顯著性，與其尾靜脈接種細胞數(shù)量無相關性，見表6。接種HL60/ADR細胞后第10天、第18天M3、M4組CD13的表達一度顯著增加，而第28天各組CD13陽性細胞比例差異亦無顯著性，見表6。

2.4 小鼠骨髓細胞學形態(tài)

于第32天或瀕死前處死小鼠，收集骨髓細胞并涂片，經瑞氏染色油鏡下觀察，因隨實驗進程，小鼠極度消瘦，生存狀態(tài)極差，處死取材時未能吹出骨髓細胞，未能得到有效制片，考慮可能與小鼠骨髓壞死相關。

2.5 小鼠臟器組織病理學觀察結果

各模型組小鼠脾正常組織結構均完全被破壞，呈現(xiàn)彌漫性異型性多核腫瘤細胞浸潤，多核、核仁清，為白血病細胞浸潤灶；肝小葉結構存在，肝細胞大量脂肪變、氣球樣變、點狀壞死，偶見白血病細胞浸潤，巨噬細胞可見(圖5)；腎組織結構基本正常，未見白血病細胞浸潤。

注：A：M1組脾(× 200)；B：M3組脾(× 200)；C：M1組肝(× 200)；D：M3組肝(× 200)；E：M1組脾(× 400)；F：M3組脾(× 400)；G：M1組肝(× 400)；H：M3組肝(× 400)。圖5 模型組小鼠組織病理形態(tài)(HE染色)Note. A: Spleen of the mice in the M1 group (× 200). B: Spleen of the mice in the M3 group (× 200). C: Liver of the mice in the M1 group (× 200). D: Liver of the mice in the M3 group (× 200). E: Spleen of the mice in the M1 group (× 400). F: Spleen of the mice in the M3 group (× 400). G: Liver of the mice in the M1 group (× 400). H: Liver of the mice in the M3 group (× 400).Figure 5 Pathomorphological tissue features of the four model groups. HE staining

3 討論

SCID beige小鼠經X線預處理后，每只尾靜脈注射1 × 107個或5 × 106個HL60、HL60/ADR細胞均可構建急性髓系白血病動物模型，符合急性髓系白血病的生物學特點，高濃度成瘤更快，但生存期短，中位生存期約29 d。

前期實驗中曾應用HL60細胞及BALB/c-nu/nu裸鼠構建模型，其中半數(shù)經2GyX線照射預處理，另半數(shù)未作處理，每只均經尾靜脈注射1 × 107個對數(shù)生長期HL60細胞，經鑒定均未成瘤，接種小鼠均生存，外周血涂片及流式檢測未檢出白血病細胞，提示存在不同種屬間體內免疫機制排異反應激活[7]。有研究顯示，BALB/c-nu/nu裸鼠可經脾切除術，環(huán)磷酰胺腹腔注射及全身亞致死量輻射預處理后，經尾靜脈注射對數(shù)生長期的人源細胞系，可成功構建白血病模型[8]。后于實驗中應用環(huán)磷酰胺1 mg/10 g體重腹腔注射BALB/c-nu/nu裸鼠3 d，又經X線照射后進行靜脈接種白血病細胞，實驗小鼠于接種細胞第3天開始死亡，至第5天全部死亡。

白血病細胞大都是NK細胞敏感性的，在不同種屬的裸鼠體內較難形成全身系統(tǒng)的白血病模型，多數(shù)僅能皮下成瘤[9]。BALB/c裸鼠為先天無胸腺鼠，缺乏T細胞免疫功能，但具有B淋巴細胞及NK細胞活性，且呈年齡依賴性[10]，而經強度較高的預處理后，經實驗驗證存活率極低。而SCID beige小鼠通過分別攜帶scid和beige常染色體隱性突變的C.B-17scid/scid小鼠和C57BL/6bg/bg小鼠雜交得到的同源系培育而來[11]。Beige基因突變小鼠降低體內NK細胞活性，并能有效改善C.B-17 SCID小鼠Leaky現(xiàn)象所造成使用上的缺陷，也較C.B-17 SCID小鼠成為更理想的細胞移植的接受者[12]。

目前建立白血病動物模型的方法主要有尾靜脈注射、腹腔注射和皮下注射三種方法[13-15]。其中操作相對簡單的皮下注射和腹腔注射，可使局部(皮下或腹腔)形成瘤塊，且接種成功率高，但通過上述兩種方式建立的模型與臨床白血病患者的實際病情發(fā)展存在較大差距。故本研究為模擬臨床白血病患者的實際病情發(fā)展特點，采用尾靜脈注射細胞的方式建立模型，使白血病細胞可隨血液循環(huán)形成全身性擴散及局部靶器官的浸潤，能更好地模擬白血病累及骨髓和彌漫生長特點，以構建符合臨床白血病病情特點的模型[16]。

本次研究利用2GyX線照射預處理，直接造成免疫系統(tǒng)損傷效應[17]，以破壞小鼠體內殘存的免疫防御系統(tǒng)?，F(xiàn)已知鼠源性腫瘤細胞的荷瘤鼠模型已較為成熟[18]，但畢竟鼠與人類之間存在種族差異，選用的SCID beige小鼠為建立人源性白血病模型提供了可能，根據(jù)既往的研究成果[19]，本研究中，經尾靜脈分別接種了1 × 107個/只、5 × 106個/只兩種不同濃度的HL60、HL60/ADR細胞株，通過接種前及接種后10 d、20 d、28 d對動物模型的形態(tài)學、分子免疫學和組織病理學檢測，發(fā)現(xiàn)1 × 107個/只發(fā)病較5 × 106個/只更快，各實驗組外周血白血病細胞比例均明顯升高，組織病理學檢查表明肝、脾臟器內均有不同程度的白血病細胞浸潤。本次實驗分別應用1 × 107個/只、5 × 106個/只細胞成功構建了人急性白血病小鼠模型，模型動物發(fā)病時間長，生存期穩(wěn)定，與課題組既往造模結果一致[20]，為藥物干預實驗提供了良好的白血病動物模型，有重要的實用價值。