李 想，童 玲，叢 喆，薛 婧

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，衛(wèi)計(jì)委人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級實(shí)驗(yàn)室，新發(fā)再發(fā)傳染病動(dòng)物模型研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

獲得性免疫缺陷綜合征是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)引起的人類免疫系統(tǒng)缺陷疾病。HIV感染細(xì)胞主要包括三個(gè)步驟：黏附、融合和進(jìn)入[1]。早期研究發(fā)現(xiàn)，HIV的主要細(xì)胞受體為CD4分子，HIV首先附著在細(xì)胞表面的CD4分子上，然后融合進(jìn)入細(xì)胞[2-3]。猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)是從靈長類動(dòng)物身上分離得到的類似于HIV的病毒，SIV恒河猴模型被認(rèn)為是研究艾滋病最有效的模型，而SIVmac239是常用的SIV病毒[4]。因此，為觀察病毒吸附和感染細(xì)胞的全過程，本研究使用SIVmac239病毒感染CEMx174細(xì)胞，通過運(yùn)用不同的技術(shù)方法，觀察病毒與CEMx174細(xì)胞的吸附，以及病毒感染細(xì)胞的整個(gè)過程。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 病毒株

感染毒株為SIVmac239，由美國Aaron Diamond艾滋病研究中心Preston Marx博士惠贈(zèng)。使用CEMx174細(xì)胞擴(kuò)增制備，TCID50為3 × 105/mL。

1.1.2 細(xì)胞

CEMx174細(xì)胞，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。懸浮生長，生長速度較快，按照1∶5傳代培養(yǎng)，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器

Anti-monkey IgG-FITC antibody(貨號：F3839-1ML)購自美國Sigma公司，goat anti-mouse IgG FITC conjugate(貨號：010300002)購自愛博生公司，小鼠抗SIV p27 Western blot單克隆抗體(克隆號：3G3)由本實(shí)驗(yàn)室制備[5]，小鼠抗SIV p27流式抗體(克隆號：4D5)由愛博生生物技術(shù)有限公司制備，IC fixation buffer(貨號：00-8222-49)和10×permeabilization buffer(貨號：00-8333-56)購自eBioscience公司。BD AccuriTMC6流式細(xì)胞儀，Leica激光共聚焦掃描顯微鏡，ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，Bio-Rad電泳儀，Tanon化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)，Nikon倒置顯微鏡，日本Hitachi CF16RXⅡ高速離心機(jī)，Dynamica臺(tái)式離心機(jī)，ESCO生物安全柜，Thermo Forma二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 病毒吸附及感染

取2 mL濃度為每毫升1 × 106個(gè)的CEMx174細(xì)胞加入六孔板中，每孔加入40 μL SIVmac239病毒，將細(xì)胞與病毒懸液混勻后置于4℃吸附30 min，吸附結(jié)束后，10 mL完全培養(yǎng)液漂洗3次，4℃、2000 r/min離心3 min，棄上清，添加新的培養(yǎng)液37℃、5% CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.2 樣本的收集與處理

CEMx174吸附病毒后，分別在0.5，12，24，48，72，96 h時(shí)，取細(xì)胞培養(yǎng)上清，提取病毒RNA，real-time PCR檢測病毒載量的變化；離心后的細(xì)胞，一部分用于制備細(xì)胞涂片，IFA檢測并用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察病毒定位及復(fù)制情況；一部分用于胞內(nèi)流式，檢測細(xì)胞內(nèi)病毒蛋白p27含量的變化；其余細(xì)胞進(jìn)行裂解，提取蛋白，利用Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)病毒蛋白p27表達(dá)量的變化。

1.3.3 培養(yǎng)上清中病毒載量的檢測[6-7]

收取不同感染時(shí)間的培養(yǎng)上清，運(yùn)用TRIzol法提取培養(yǎng)上清中的病毒RNA，根據(jù)SIVgag基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，利用real-time PCR測定培養(yǎng)上清中的病毒RNA，實(shí)驗(yàn)步驟詳見參考文獻(xiàn)[6-7]。

1.3.4 IFA檢測SIVmac239病毒抗原[8]

將收取的細(xì)胞用PBS洗兩次后，調(diào)整至合適的細(xì)胞濃度，涂于玻片孔中干燥后冰丙酮固定30 min。SIV感染猴血漿滅活后用PBS(1∶20)稀釋，滴加至玻片孔中，將滴加完成的玻片放入濕盒內(nèi)，37℃孵育30 min。孵育結(jié)束后，取出玻片，PBS漂洗3次，每次浸泡5 min，其間輕輕震搖數(shù)次。用紙巾拍干，加入PBS稀釋的anti-monkey IgG-FITC antibody(1∶400)，滴加完成后放入濕盒，37℃孵育30 min。孵育結(jié)束后，PBS漂洗3次，每次浸泡5 min，其間輕輕震搖數(shù)次。紙巾拍干，DAPI封片后，即可在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.3.5 胞內(nèi)流式檢測SIVmac239病毒p27蛋白[9]

收取細(xì)胞，每管1 × 106個(gè)細(xì)胞，加入100 μL IC fixation buffer于4℃固定20 min，加入2 mL 1× permeabilization buffer于4℃、2000 r/min離心3 min，洗2次后100 μL重懸細(xì)胞，加入1 μg SIV p27流式抗體，4℃孵育30 min。孵育結(jié)束洗2次后，100 μL重懸細(xì)胞，加入2 μg goat anti-mouse IgG FITC conjugate，4℃孵育30 min。孵育結(jié)束后，分別用2 mL 1× permeabilization buffer洗2次和2 mL PBS洗1次，適量PBS重懸細(xì)胞后流式儀檢測p27表達(dá)量。

1.3.6 Western blot檢測CEMx174細(xì)胞中p27蛋白表達(dá)[5]

病毒感染細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞，用RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，并用BCA法測定蛋白的濃度。取30 μg總蛋白100℃變性后，12% SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至NC膜上，含5%脫脂奶粉的TBST封閉，小鼠抗SIV p27單克隆抗體用封閉液1∶2000稀釋后，4℃孵育過夜。二抗為辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠抗體，內(nèi)參用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的β-actin抗體，均用TBST 1∶15 000稀釋，室溫孵育1 h，加入酶作用底物顯影后，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 SIVmac239感染CEMx174過程中的細(xì)胞病變

SIVmac239感染CEMx174細(xì)胞后48 h即可出現(xiàn)個(gè)別明顯的細(xì)胞病變——多細(xì)胞融合形成巨大的融合泡(圖1B)；到感染后96 h時(shí)，細(xì)胞病變嚴(yán)重，出現(xiàn)大量的晚期細(xì)胞融合泡，泡內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失甚至融合泡破裂，內(nèi)容物溢出(圖1C)。

注：A：正常CEMx174細(xì)胞(× 20)；B：SIVmac239感染48 h時(shí)的CEMx174細(xì)胞(× 20)；C：SIVmac239感染96 h時(shí)的CEMx174細(xì)胞(× 20)。箭頭指示細(xì)胞病變。圖1 SIVmac239病毒感染CEMx174細(xì)胞后的細(xì)胞病變Note. A: Uninfected CEMx174 cells (× 20); B: CPE of CEMx174 cells at 48 hours post-infection by SIVmac239 (× 20); C: CPE of CEMx174 cells at 96 hours post-infection of SIVmac239 (× 20). Arrows indicate the cytopathic effect.Figure 1 Cytopathic effect (CPE) in CEMx174 cells infected by SIVmac239

2.2 SIVmac239感染CEMx174細(xì)胞過程中培養(yǎng)上清病毒載量的變化

SIVmac239病毒在4℃吸附細(xì)胞CEMx174 0.5 h后，檢測上清中病毒載量，結(jié)果顯示，上清中的病毒RNA水平為每毫升1 × 104.5拷貝，病毒感染細(xì)胞12 h時(shí)培養(yǎng)上清中病毒載量下降，為每毫升1 × 104拷貝，此后至病毒感染細(xì)胞96 h，培養(yǎng)上清中的病毒RNA水平持續(xù)升高至每毫升1 × 109拷貝。如圖2所示。

圖2 SIVmac239感染CEMx174細(xì)胞過程中培養(yǎng)上清病毒載量的變化Figure 2 Viral RNA level in culture supernatants of SIVmac239-infected CEMx174 cells

2.3 使用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測SIVmac239感染CEMx174細(xì)胞的過程

SIVmac239病毒4℃吸附細(xì)胞CEMx174 0.5 h后，細(xì)胞膜上檢測到綠色點(diǎn)狀熒光，綠色點(diǎn)狀熒光所在的位置即為病毒所在的位置(圖3B)。病毒感染細(xì)胞12，24，48 h時(shí)，在細(xì)胞膜上均觀察到綠色點(diǎn)狀熒光。感染至第72 h和第96 h時(shí)，細(xì)胞胞漿內(nèi)檢測到大量的綠色點(diǎn)狀熒光(圖3C、3D)，呈現(xiàn)新月狀、戒指狀或圓環(huán)狀。

2.4 SIVmac239感染CEMx174過程中胞內(nèi)p27蛋白表達(dá)量的變化

SIVmac239感染CEMx174細(xì)胞后，胞內(nèi)流式和蛋白質(zhì)免疫印跡檢測細(xì)胞內(nèi)病毒蛋白p27的表達(dá)。胞內(nèi)流式結(jié)果顯示感染至第24 h時(shí)，可以檢測到病毒蛋白p27，但與感染第12 h相比，無明顯變化。感染至第48 h時(shí)，表達(dá)病毒蛋白p27的細(xì)胞所占百分比為(1.05±0.10)%，比例明顯增加(P< 0.01)；

注：A：正常CEMx174細(xì)胞(× 63)；B ～ D：SIVmac239病毒感染細(xì)胞0.5，72，96 h時(shí)抗原檢測(× 63)。箭頭所指的點(diǎn)狀綠色熒光，即為病毒所在的位置。圖3 IFA檢測感染SIVmac239病毒的CEMx174細(xì)胞內(nèi)的病毒抗原Note. A: Uninfected CEMx174 cells (× 63); B-D: Detection of the antigen on cells at 0.5, 72, and 96 h post-infection by SIVmac239 (× 63). The green fluorescence dot pointed by the arrow indicates the location of the virus.Figure 3 IFA showing the virus antigen in SIVmac239-infected CEMx174 cells

注：A、B：胞內(nèi)流式檢測不同時(shí)間細(xì)胞內(nèi)p27的變化；C：蛋白質(zhì)免疫印跡檢測病毒感染細(xì)胞0.5，12，24，48，72 h及96 h p27蛋白表達(dá)量的變化。感染48 h時(shí)與正常對照組相比，** P< 0.01。圖4 SIVmac239感染的CEMx174細(xì)胞內(nèi)p27蛋白表達(dá)量的變化Note. A, B: Intracellular cytokine staining (ICS) shows the expression of SIV p27 in different times. C: The expression of SIV p27 in CEMx174 cells 0.5, 12, 24, 48, 72 and 96 hours post infection of SIVmac239. Compared with normal control group when infected with 48 h,** P < 0.01.Figure 4 Change in the expression of SIV p27 in SIVmac239-infected CEMx174 cells

此后至感染第96 h，表達(dá)SIV p27的細(xì)胞所占的比例逐漸升高，至第96 h時(shí)所占的比例為(19.75±0.64)%(圖4A、4B)。

蛋白質(zhì)免疫印跡陰性對照為未感染病毒的正常CEMx174細(xì)胞，在1 ～ 7泳道內(nèi)參蛋白條帶灰度大致相同的情況下，檢測細(xì)胞胞漿中的p27蛋白。病毒吸附感染細(xì)胞0.5 ～ 24 h細(xì)胞胞漿中未能檢測到病毒蛋白p27，在病毒感染CEMx174細(xì)胞48 h時(shí)開始檢測到病毒蛋白p27，并且在之后的48 h，細(xì)胞胞漿中的SIV p27表達(dá)量呈逐漸遞增的趨勢(圖4C)。

3 討論

早期研究發(fā)現(xiàn)，HIV在感染細(xì)胞時(shí)首先黏附在細(xì)胞上，然后再進(jìn)入細(xì)胞[10]。為觀察病毒吸附細(xì)胞及病毒感染細(xì)胞的全過程，本研究用SIVmac239病毒感染CEMx174細(xì)胞，運(yùn)用不同的技術(shù)方法，觀察病毒與細(xì)胞吸附以及病毒感染細(xì)胞的全過程。

本研究中，SIVmac239病毒4℃吸附細(xì)胞0.5 h后，間接免疫熒光法檢測病毒的定位，結(jié)果顯示，細(xì)胞膜上檢測到病毒顆粒，表明病毒在感染細(xì)胞時(shí)，首先吸附在細(xì)胞膜上，但是檢測到的吸附在細(xì)胞膜上的病毒顆粒較少，說明雖然在吸附感染時(shí)加入的病毒量很大，但是能有效吸附細(xì)胞的病毒較少。在對培養(yǎng)上清中的病毒RNA進(jìn)行檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)，SIVmac239病毒吸附感染細(xì)胞第0.5 h至第96 h，培養(yǎng)上清中均能檢測到病毒RNA，病毒感染細(xì)胞12 h后，培養(yǎng)上清中的病毒載量下降，但是與加入的病毒相比下降不明顯，從而可知，病毒在感染細(xì)胞時(shí)，能真正感染細(xì)胞的病毒較少，推測一定量的細(xì)胞在被病毒感染時(shí)，能感染細(xì)胞的病毒具有最大量，當(dāng)病毒的量超出最大限度時(shí)，超出部分的病毒將無法感染細(xì)胞。在檢測病毒的核心蛋白p27時(shí)，病毒感染細(xì)胞第24 h時(shí)，胞內(nèi)流式即可檢測到病毒蛋白p27，而Western blot在病毒感染細(xì)胞48 h時(shí)開始檢測到病毒蛋白p27，此后至病毒感染細(xì)胞96 h，SIV核心蛋白p27表達(dá)量逐漸升高，與培養(yǎng)上清中的病毒RNA、間接免疫熒光檢測病毒復(fù)制情況的變化趨于一致。

綜上所述，SIVmac239感染細(xì)胞CEMx174時(shí)，病毒首先吸附在細(xì)胞膜上，然后進(jìn)入細(xì)胞，從感染后第12 h隨著感染時(shí)間的增加，培養(yǎng)上清中病毒RNA水平持續(xù)升高，病毒持續(xù)復(fù)制，細(xì)胞內(nèi)病毒核心蛋白p27的表達(dá)量逐漸增加。另外，檢測水平和實(shí)驗(yàn)方法不同，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)不同程度的差別，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的和需要，選擇合適的檢測水平和實(shí)驗(yàn)方法。